ВС разъяснил, когда наследником может стать не родственник покойного

Фото: Moscow Live

Наследником по закону может быть признано нетрудоспособное лицо, находившееся на иждивении наследодателя на момент его смерти. При этом не имеют значения родственные отношения между ними, говорится в четвертом обзоре практики Верховного суда в 2020 году.

Гражданка Иванова (фамилия изменена — L.R) более 35 лет состояла в фактических отношениях с мужчиной, с которым проживала в частном доме. Брак при этом зарегистрирован не был. Женщина со II группой инвалидности находилась на полном материальном обеспечении сожителя. Принадлежащую ему квартиру пара сдавала. В 2017 году мужчина умер, после чего Иванова подала к департаменту городского имущества Москвы иск о признании права собственности на жилье покойного.

Чиновники мэрии подали встречный иск и потребовали выселения Ивановой. По мнению властей, какие-либо наследники на спорное имущество как по закону, так и по завещанию отсутствуют. Все суды отказали Ивановой в иске и встали на сторону мэрии.

Судебная коллегия по гражданским делам Верховного суда РФ с нижестоящими инстанциями не согласилась.

ВС напомнил о п. 2 и 3 ст. 1148 ГК РФ, согласно которым к наследникам по закону относятся граждане, которые не менее года до смерти наследодателя находились на его иждивении и проживали совместно с ним. При наличии других наследников по закону они наследуют вместе и наравне с наследниками той очереди, которая призывается к наследованию. При отсутствии других наследников нетрудоспособные иждивенцы наследодателя наследуют самостоятельно в качестве наследников восьмой очереди.

Еще в 2012 году Пленум ВС постановил, что находившимся на иждивении наследодателя может быть признано лицо, получавшее от умершего в период не менее года до его смерти полное содержание или такую систематическую помощь, которая была постоянным и основным источником средств к существованию, независимо от получения им собственного заработка, пенсии, стипендии и других выплат. Родственные отношения при этом не имеют значения.

«Факт совместного проживания в частном доме подтвержден соответствующими свидетельствами о регистрации по месту пребывания, актом комиссии управления социальной защиты населения, а также показаниями свидетелей», — указал ВС.

Кроме того, как указал ВС, понятие «иждивение» предполагает как полное содержание лица умершим, так и получение от него содержания, являвшегося для этого лица основным, но не единственным источником средств к существованию, то есть не исключает наличие у лица какого-либо собственного дохода (получение пенсии).

Факт нахождения на иждивении либо получения существенной помощи от умершего может быть установлен в том числе в судебном порядке путем определения соотношения между объемом помощи, оказываемой умершим и его собственными доходами, и такая помощь также может быть признана постоянным и основным
источником средств к существованию.

ВС направил дело на новое рассмотрение в суд первой инстанции.

Статья 1148 ГК РФ. Наследование нетрудоспособными иждивенцами наследодателя

 [Гражданский кодекс РФ] [Ст. 1148 ГК РФ]

Оглавление:

Статья 1148 ГК РФ. Наследование нетрудоспособными иждивенцами наследодателя

Комментарий к статье 1148 ГК РФ

Судебная практика по статье 1148 ГК РФ

---

Статья 1148 ГК РФ.

1. Граждане, относящиеся к наследникам по закону, указанным в статьях 1143 — 1145 настоящего Кодекса, нетрудоспособные ко дню открытия наследства, но не входящие в круг наследников той очереди, которая призывается к наследованию, наследуют по закону вместе и наравне с наследниками этой очереди, если не менее года до смерти наследодателя находились на его иждивении, независимо от того, проживали они совместно с наследодателем или нет.

2. К наследникам по закону относятся граждане, которые не входят в круг наследников, указанных в статьях 1142 — 1145 настоящего Кодекса, но ко дню открытия наследства являлись нетрудоспособными и не менее года до смерти наследодателя находились на его иждивении и проживали совместно с ним. При наличии других наследников по закону они наследуют вместе и наравне с наследниками той очереди, которая призывается к наследованию.

3. При отсутствии других наследников по закону указанные в пункте 2 настоящей статьи нетрудоспособные иждивенцы наследодателя наследуют самостоятельно в качестве наследников восьмой очереди.

Статья 1147 ГК РФ  | Статья 1148 | Статья 1149 ГК РФ

Гражданский Кодекс РФ

---

Комментарий к статье 1148 ГК РФ

В статье 1148 ГК РФ регламентируется порядок наследования нетрудоспособными иждивенцами наследодателя.

Законодатель разделил нетрудоспособных иждивенцев на тех, кто входит в очереди наследников (со второй по седьмую) и тех, которые не входят в указанные очереди (нет родства наследодателя с указанными наследниками).

Установлено правило, согласно которому наследники, относящиеся к первому критерию, вступают в наследство наравне с привлеченной очередью наследников и наследуют в равных долях, даже если они по родству относятся к наследникам последующей очереди.

Так в случае смерти наследодателя, если у него был единственный сын и брат на иждивении, они будут наследовать в равных долях, хотя и относятся к наследникам разной очереди: сын является наследником первой очереди, брат — третьей очереди. Если бы брат не находился на иждивении у наследодателя, при наличии сына, он бы вовсе не наследовал поскольку, как было указано выше, относится к наследникам третьей очереди.

Нетрудоспособные лица, не имеющие родства с наследодателем, но находящиеся на его иждивении более года и совместно с ним проживающие, наследуют аналогично нетрудоспособным иждивенцам, имеющих с ним родство. Они призываются к наследованию наравне с очередью привлеченной к наследованию (с первой по седьмую), а если представителей данных очередей нет, то формируют самостоятельную очередь наследников — восьмую.

К нетрудоспособным наследникам применяется правило о недостойных наследниках, в случае совершения ими противоправных действий против наследодателя или других наследников, в целях получения ими или другими лицами наследства или увеличения причитающихся им доли в наследстве. Так, если будет иметься приговор суда в отношении нетрудоспособных иждивенцев из-за совершенного ими противоправного действия против наследодателя, они будут лишены права на наследование его имущества.

Если на день открытия наследства умер сын наследодателя, но остались его дети (внуки наследодателя) и нетрудоспособный иждивенец, половина наследства в данном случае перейдет иждивенцу, а вторая половина будет поделена между внуками поровну, поскольку они наследуют по праву представления.

При наследовании нетрудоспособными наследниками, находящимися на иждивении у наследодателя и имеющие с ним родство, в целях принятия наследства необходимо предоставить нотариусу документы, подтверждающие данное родство и документы подтверждающие отсутствие у них трудоспособности (справка об инвалидности). Если к наследству призывается гражданин, находящийся на иждивении у наследодателя и не имеющий с ним родства, ему необходимо предоставить кроме документа, подтверждающего данную нетрудоспособность, еще документ, свидетельствующий о совместном проживании с наследодателем более года (например, справку из домовой книги).

Нетрудоспособным считается несовершеннолетний, лицо, достигшее пенсионного возраста, а также человек, не способный выполнять трудовые функции по состоянию здоровья (например, инвалид).

Иждивенцем считается лицо, находящееся на содержании наследодателя, если данное содержание является основным источником к его существованию (хотя и не единственным). При этом данное содержание должно носить системный характер.

---

Судебная практика по статье 1148 ГК РФ

2-7046/2015 ~ М-7194/2015 Решение Новгородского районного суда Новгородской области

2-2609/2015 ~ М-2441/2015 Решение Электростальского городского суда Московской области

2-83/2016 (2-2302/2015) ~ М-2229/2015 Решение Рузского районного суда Московской области

2-5709/2015 ~ М-5191/2015 Решение Сергиево-Посадского городского суда Московской области

2-1045/2015 ~ М-464/2015 Решение Подольского городского суда Московской области

2-4516/2015 ~ М-3831/2015 Заочное решение Сергиево-Посадского городского суда Московской области

2-2770/2015 ~ М-2455/2015 Решение Серпуховсого городского суда Московской области

2-2619/2015 ~ М-3291/2015 Решение Ступинского городского суда Московской области

2-6031/2015 ~ М-5928/2015 Решение Приволжского районного суда города Казани Республики Татарстан

2-14400/2015 ~ М-13566/2015   Решение Вахитовского районного суда г. Казани Республики Татарстан

2-12305/2015 ~ М-11199/2015   Решение Вахитовского районного суда г. Казани Республики Татарстан

2-4049/2015 ~ М-2270/2015  Решение Вахитовского районного суда г. Казани Республики Татарстан

2-3733/2015 ~ М-1909/2015  

Решение Вахитовского районного суда г. Казани Республики Татарстан

2-13008/2015 ~ М-11811/2015  Решение Вахитовского районного суда г. Казани Республики Татарстан

Сохраните, чтобы не потерять.

Facebook

Twitter

Вконтакте

Одноклассники

Google+

Ст. 1148 ГК РФ с комментариями 2021 года: наследование нетрудоспособными иждивенцами наследодателя

Действующий Гражданский кодекс знает два вида перехода права собственности после смерти наследодателя к его преемникам: по завещанию и по условиям действующего закона. Особой категорией наследников являются нетрудоспособные иждивенцы. Они могут быть как родственниками покойного, так и не имеющими кровной с ним связи. По условиям ст. 1148 ГК, такие лица обязаны проживать совместно с ним в течение не меньше одного года и находиться все это время на его содержании.

Содержание статьи:

Понятие и правовой статус нетрудоспособных иждивенцев

Действующее законодательство не содержит конкретного понятия «нетрудоспособность». Поэтому, по общепринятому подходу юристов, к таким лицам относятся граждане, которые с учетом своего возраста или состояния здоровья, не могут заниматься физическим трудом или ухаживать самостоятельно за собой.

Под иждивенцем юридическая практика понимает конкретное лицо, которое на постоянной основе получает материальную и финансовую помощь от другого гражданина. За счет такого содержания человек и существует.

Данная категория состоит из стариков и детей. Таким образом, наследование нетрудоспособными иждивенцами наследодателя возможно для лиц, которыми являются:

• пенсионеры из числа женщин, которым 55 лет и старше, мужчин – 60 и более лет;
• инвалидов с детства;
• инвалидов первой, второй и третьей груп;
• несовершеннолетних.

Отдельная категория наследников состоит из нетрудоспособных иждивенцев, которые хотя и подпадают под такое определение, однако входят в первую линию наследников. Это:

• супруг покойного;
• его родители;
• дети кровного родства, а также усыновленные или удочеренные.

Отнесение их к первой линии преемства дает приоритет по сравнению с другими претендентами на богатство умершего родственника. Поэтому, указанная категория лиц даже не упоминается в первом пункте статьи 1148 ГК. Однако в комментариях к законодательной норме им уделено достаточное внимание. Что касается гражданской жены покойного, то отсутствие официального брака лишает ее пребывание в первой линии, если только она не иждивенец.

Законодатель не допускает призвания к наследованию по закону нетрудоспособных иждивенцев, которые, согласно статье 601 ГК получают от покойного пожизненное содержание на условиях договора ренты. Это своего рода его работа.

Так как эти правоотношения основываются на платной основе, то такие лица после наступлении смерти плательщика рентных взносов получают материальную и финансовую поддержку от наследников умершего. А конкретно – от преемника, который в наследство получил имущество, обремененное рентой.

Как подтвердить юридический факт нахождения на иждивения и статус нетрудоспособности: доказательная база

Процедура наследования нетрудоспособного иждивенца по закону после смерти собственника имущества состоит с том, что он самостоятельно обязан подтвердить не только сам факт нахождения на постоянном содержании у покойного, но также свое физическое состояние. Гражданский кодекс, регламентирующий наследственные правоотношения, не содержит критериев, по которым можно отнести таких лиц к претендентам на преемство.

Поэтому, следует обращаться к другим отраслям права. Так, руководствуясь пенсионными нормами, можно отнести к категории нетрудоспособных:

• женщин, которым исполнилось 55 и более лет;
• мужчин, возрастом старше 60 лет.

Закон, регулирующий социальное обеспечение, позволяет присоединить к данным лицам инвалидов, независимо от назначенной им группы, а также несовершеннолетних. Федеральное законодательство об образовании говорит и о совершеннолетних возрастом до 23 лет, которые учатся в высших учебных заведениях. Однако форма обучения должна быть очной.

Согласно разъяснениям Верховного Суда Российской Федерации, перечисленную категорию граждан можно отнести к иждивенцам, если средства, которые они получали от умершего, являлись для них главным и основным источником существования. А факт приобретения нетрудоспособности должен припадать не позже, чем дата, когда наследство было открыто.

Согласно требованиям статьи 1148 ГК, процедура по призванию нетрудоспособных иждивенцев к наследованию, основывается на совокупности обстоятельств, актуальность которых действенна и сегодня. К ним следует отнести:

• пребывание на содержании покойного от одного года и более;
• подтвержденная документально нетрудоспособность;
• проживание совместно с умершим более 12 месяцев до дня его смерти.

Соответственно, в зависимости от ситуации, иждивенцу нужно будет предоставить нотариусу возможные имеющиеся документы:

• Заключение медицинской комиссии о присвоении группы инвалидности, которая делает человека нетрудоспособным.
• Справку о доходах.
• Копию пенсионного удостоверения.
• Справку об обучении в ВУЗе на дневном стационаре.
• Справку о прописке (фактическом проживании) в квартире умершего гражданина не менее 1 года.

Указанные граждане представляют особую категорию лиц, которым предоставлено право наследовать по закону. Взаимоотношения с покойным не связываются кровным родством. Участие их в преемстве стало возможно благодаря внесению изменений, которые произошли в наследственном праве после 1964 года.

Порядок наследования

Суть процедуры вступления в свои права со стороны нетрудоспособных иждивенцев заключается в том, что закон предоставляет им одностороннюю возможность наследования после кончины кормильца. Это означает следующее: если гражданин пребывает на содержании у нетрудоспособного, то не имеет никакого законного права преемствовать после его кончины.

Если отсутствуют родственники, которые могут претендовать на наследство после наступления смерти собственника имущества – то к преемству по закону призывают восьмую линию. Она как раз и представлена нетрудоспособными иждивенцами. К данной категории лиц, согласно ст. 1148 ГК РФ, относятся две группы граждан:

1. Первая состоит из родственников второй и последующих очередей. Они подлежат призыву к наследованию по закону, однако являются нетрудоспособными.
2. Во вторую входят иждивенцы наследодателя, находящиеся в состоянии нетрудоспособности. Родственные отношения на это не влияют. То есть, это могут быть и совершенно посторонние лица.

В обоих случаях, наследование нетрудоспособными иждивенцами со стороны наследодателя требует, чтобы данные лица пребывали на содержании собственника имущества не менее одного года. В во втором – еще и проживать совместно с ним такое время.

Действующее законодательство предполагает два основания возникновения иждивения. Это самостоятельное решение со стороны наследодателя выполнить моральный долг в отношении нетрудоспособного лица, а также исполнение алиментных обязательств добровольно или принудительно. Например, через суд. Как показывает практика, к такому решению собственник имущества обычно приходит после получения ответов от консультанта-юриста на интересуемые вопросы.

Правовые отношения предусматривают следующий порядок по наследованию нетрудоспособными иждивенцами:

1. Если такие лица относятся к первой линии наследников, то их призывают к преемству по закону вне зависимости от того, проживали ли они совместно с покойным в течение не менее года до дня его смерти. Размер их доли будет одинаковый с другими наследниками этой линии.
2. Если нетрудоспособные иждивенцы не относятся к кровным родственникам, то они могут призываться к преемству, только если проживали с собственником наследства последний год, и его содержание для них было основным источником существования. Данную категорию составляют нетрудоспособные иждивенцы со второй и последующих линий преемства.

Соблюдение данного порядка преследует решение двуединой задачи. Во-первых, гарантированно защищаются из права и законные интересы, не зависимо от наличия наследников, входящих в число близких родственников. Во-вторых, во время процедуры наследования такие лица отстранению от преемства не подлежат.

Для доказывания своего права на наследование по закону, следует подтвердить существование юридического факта, с которым закон это связывает. Данный вопрос является актуальным при наличии спора или возражений со стороны других претендентов. В любом случае, если появляется необходимость в получении от нотариуса соответствующего свидетельства, придется обращаться с заявлением в судебный орган.

Особенности наследования по требованиям закона

Согласно п. 1 части 2 ст. 1148 Гражданского кодекса, независимо от наличия завещания, к наследованию обязательно призывается определенная категория граждан. На их долю приходится не менее половины всей массы богатства покойного. Это касается:

1. Детей умершего, которые пребывают в несовершеннолетнем возрасте или нетрудоспособном состоянии.
2. Иждивенцев, пребывающих в нетрудоспособном состоянии.

При определенных обстоятельствах в наследование по закону вступает и государство. Чтобы это было возможным, необходимо:

• полное отсутствие наследников;
• отстранение в законный способ таких лиц от права преемства после умершего;
• никто из претендентов не выразил желания принять наследство;
• все преемники отказались вступать в свои права, подав соответствующее заявление нотариусу;
• имущество покойного признано судом выморочным.

Порядок перехода собственности физических лиц государству определяется действующим законодательством. Эта процедура, как и во всех остальных случаях, требует времени, за которое могут объявиться наследники, просрочившие время, отведенное на вступление в имущественные права прежде.

Следовательно, статья 1148 Гражданского кодекса Российской Федерации предусматривает условия и порядок перехода имущественных прав от умершего гражданина к его нетрудоспособному иждивенцу. Для этого последнему нужно собрать всю доказательственную базу, справки (подтверждающие нетрудоспособность, отсутствие личного дохода и факт проживания с умершим на одной жилплощади) и обратиться к нотариусу для получения своей доли наследства наряду с остальными претендентами.

Наследование нетрудоспособными иждивенцами наследодателя

Вопрос наследования имущества умершего родственника на территории Российской Федерации традиционно считается одним из самых специфичных и сложных в силу того, что законные правила принятия наследства знают отнюдь не многие граждане.

Однако еще более проблематичной является ситуация, когда у наследодателя при жизни находились на иждивении нетрудоспособные лица. Чтобы четко разобраться в этой ситуации, следует учитывать ряд особенностей отечественного законодательства и общие положения вопроса.

Ключевые различия между наследованием родственников и нетрудоспособных иждивенцев

Согласно действующему законодательству, нетрудоспособные иждивенцы — это особая категория наследников, поскольку наследодатель с ними не связан ни супружескими, ни родственными узами. Тем не менее, юридическая связь между наследодателем и иждивенцами существует и определяется она следующими обстоятельствами, предусмотренными статьей 1148 Гражданского Кодекса Российской Федерации:

• нетрудоспособное лицо находилось на иждивении у наследодателя не меньше года до его дня смерти. Это значит, что любой другой срок, который будет меньше указанного, позволяет сделать вывод, что нетрудоспособное лицо не может претендовать ни на какую часть наследства;
• наличие документальных доказательств нетрудоспособности иждивенца. Для этого должны быть предоставлены любые документы, которые могут стать юридическим основанием для признания лица нетрудоспособным по закону;
• совместное проживание иждивенца и наследодателя в течение минимум года до смерти последнего. Нужно отметить, что данное условие обязательно не для всех случаев. С полным перечнем ситуаций можно ознакомиться в соответствующей статье ГК РФ.

Еще одна особенность, отличающая наследование имущества умершего родственниками и иждивенцами, заключается в том, что в первом случае такое право является двусторонним, а во втором — односторонним.

К примеру, супруги в равной степени наследуют имущество друг после друга. Что же касается нетрудоспособного иждивенца, то здесь только он может считаться наследником, в то время как лицо, у которого он находится на иждивении, — нет.

Права иждивенцев

Когда еще иждивенцы могут претендовать на наследство, а когда — нет?

Важно помнить и о том, что все ситуации, при которых нетрудоспособный иждивенец может стать наследником, приведены в исчерпывающем перечне в Гражданском Кодексе РФ. В частности, отношения иждивения возникают как:

• добровольное волеизъявление лица, берущего опеку над нетрудоспособным гражданином; добровольное исполнение обязательств по вопросу алиментов;
• принудительное исполнение обязательств по вопросу алиментов.

В то же время, нетрудоспособный иждивенец, заключивший договор с умершим на пожизненное содержание по договору ренты, не может выступать в качестве наследника, поскольку здесь имело место быть встречное предоставление. Соответственно, формально не было односторонней помощи нетрудоспособному лицу, а предоставлялась услуга в обмен на другую услугу.

Нужно также заметить, что в последнем случае наследниками умершего становятся его родственники, которые точно так же обязуются взять на иждивение нетрудоспособное лицо по договору ренты.

Категории нетрудоспособных иждивенцев

Современный Гражданский Кодекс, в отличие от своего советского прототипа, делит нетрудоспособных лиц, находящихся на иждивении, на две группы:

• первая — те, кому не обязательно проживать вместе с наследодателем для получения его имущества после смерти. К данной категории относятся законные наследники, начиная со второй и последующих очередей наследования. При этом они не должны находиться в очереди, которая к моменту смерти наследодателя будет призвана к наследованию;
• вторая — те, кто не относится к родственникам и, соответственно, не входит в какую-либо очередь принятия наследования вообще. Согласно действующему законодательству, нетрудоспособные иждивенцы, входящие в первую очередь наследования, вообще не упоминаются в качестве таковых, поскольку де-юре и де-факто они и так получат полагающуюся им по закону долю имущества умершего.

Ст. 1148 ГК РФ. Наследование нетрудоспособными иждивенцами наследодателя

Бесплатные консультации

Ст. 1148 ГК РФ. Наследование нетрудоспособными иждивенцами наследодателя

подразумевает наличие нескольких пунктов:

1. Граждан, относящийся к наследнику по закону, указанном в статьях 1143-1145 Кодекса, нетрудоспособный до дня открытия наследства, однако не входящий к кругу наследников, наследует по законодательству вместе и наравне с наследником этой очереди, если не меньше одного года до смерти наследодателей находился на его иждивении

2. К наследнику по закону относится граждан, который не входит к кругу наследников, которые указанные в статьях 1142-1145 Кодекса, но до дня открытия наследства являлся нетрудоспособным и не меньше одного года до смерти наследодателей находился на его иждивении и проживал совместно с ним. Если есть другие наследники по закону, они наследуют вместе и наравне с наследником той очереди, которая способна призываться к наследованию.

3. Если отсутствуют другие наследники по закону, то нетрудоспособный иждивенец наследодателя наследует самостоятельно как наследник восьмой очереди.Нетрудоспособный иждивенец, призываемый к наследованию по законодательству в порядке и на условии, предусмотренном Ст. 1148 ГК РФ., бывает двух групп.

Первая группа — нетрудоспособный иждивенец, который входит к кругу наследников по законодательству следующей (вторая — седьмая) очереди, однако не входит к круг наследников по законодательству той очереди, которую призвано к наследованию.

Вторая группа — это нетрудоспособный иждивенец, который не входит к кругу наследников по законодательству ни первой, ни последующей очереди. Согласно Ст. 1148 ГК РФ. Наследование нетрудоспособными иждивенцами наследодателя, если есть другие наследники по законодательству, они наследуют вместе с наследником той очереди, которую призывают к наследованию. Если же другого наследника по закону нет, нетрудоспособный иждивенец наследодателя наследует самостоятельно как наследник восьмой очереди.

Наши специалисты предлагают помощь в решении юридических проблем, в том числе связанных с данной статьей.

Задайте свой вопрос прямо сейчас и получите юридическую консультацию бесплатно!

На ваши вопросы отвечают компетентные юристы, специализирующиеся на различных областях права. Для того чтобы направить свой вопрос профильному специалисту, пожалуйста, заполните поля с контактными данными — укажите свое имя, актуальный телефон с кодом города, кратко опишите проблему, отправьте заявку и получите помощь юриста по телефону через 15 минут!

Задайте свой вопрос и получите юридическую консультацию бесплатно!

Конфиденциальность информации гарантируется

Опишите свою ситуацию и получите квалифицированную юридическую помощь прямо сейчас!

Дополнительные материалы по теме: Ст. 1148 ГК РФ. Наследование нетрудоспособными иждивенцами наследодателя

Понятие, сущность и основания иждевения (наследственно-правовой аспект)

Правовые основы иждивения были заложены в глубокой древности. Уже в Древней Греции, во времена Перикла (V век до н.э.), существовал закон, по которому видные государственные деятели в старческом возрасте переходили на иждивение государства. В последующем содержание одного лица другим пробрело различные публично-правовые (социальное обеспечение, алиментирование и пр.) и частноправовые формы (гражданско-правовые обязательства содержания с иждивением), стало обязательным или возлагалось на себя добровольно. Современное российское отраслевое законодательство содержит различные определения нетрудоспособных иждивенцев, но так или иначе сводится к тому, что лицо признается иждивенцем, если находится на полном содержании или получает от другого лица помощь, которая является для него постоянным и основным источником средств к существованию*.

———————————

* Например, согласно ст. 9 Федерального закона «О трудовых пенсиях в Российской Федерации» нетрудоспособными членами семьи умершего кормильца, состоявшими на его иждивении, признаются:

1) дети, братья, сестры и внуки умершего кормильца, не достигшие возраста 18 лет, а также дети, братья, сестры и внуки умершего кормильца, обучающиеся по очной форме в образовательных учреждениях всех типов и видов независимо от их организационно-правовой формы, за исключением образовательных учреждений дополнительного образования, до окончания ими такого обучения, но не дольше чем до достижения ими возраста 23 лет, или дети, братья, сестры и внуки умершего кормильца старше этого возраста, если они до достижения возраста 18 лет стали инвалидами, имеющими ограничение способности к трудовой деятельности. При этом братья, сестры и внуки умершего кормильца признаются нетрудоспособными членами семьи при условии, что они не имеют трудоспособных родителей;

2) один из родителей или супруг либо дедушка, бабушка умершего кормильца независимо от возраста и трудоспособности, а также брат, сестра либо ребенок умершего кормильца, достигшие возраста 18 лет, если они заняты уходом за детьми, братьями, сестрами или внуками умершего кормильца, не достигшими 14 лет и имеющими право на трудовую пенсию по случаю потери кормильца в соответствии с подпунктом 1 настоящего пункта, и не работают;

3) родители и супруг умершего кормильца, если они достигли возраста 60 и 55 лет (соответственно мужчины и женщины) либо являются инвалидами, имеющими ограничение способности к трудовой деятельности;

4) дедушка и бабушка умершего кормильца, если они достигли возраста 60 и 55 лет (соответственно мужчины и женщины) либо являются инвалидами, имеющими ограничение способности к трудовой деятельности, при отсутствии лиц, которые в соответствии с законодательством Российской Федерации обязаны их содержать.

В соответствии со ст. 53 Закона РФ «О государственных пенсиях в Российской Федерации» иждивенцем признается лицо, которое получает от кормильца такую помощь или содержание, которые являются постоянным и единственным источником средств к существованию. Таким образом, к числу иждивенцев относятся лица, проживающие на средства другого гражданина (как состоящие, так и не состоящие с ним в родстве) и не имеющие самостоятельного источника дохода, однако пенсионеры к числу иждивенцев не относятся.

Традиция же включения иждивенцев в круг наследников по закону относительно нова и связана, как ни странно это звучит, с отменой наследования одним из первых актов советского гражданского законодательства — Декретом ВЦИК от 27 апреля 1918 г. «Об отмене наследования». В ст. 2 данного Декрета устанавливалось, что впредь до издания декрета о всеобщем социальном обеспечении нуждающиеся нетрудоспособные родственники по прямой восходящей и нисходящей линии, братья и сестры, а также супруг умершего получают из оставшегося после умершего имущества содержание. Это не было в прямом смысле ни наследованием, ни социальным обеспечением, а представляло собой некий суррогат частноправового обеспечения нетрудоспособных родственников, однако предопределило особое отношение законодателя в будущем к подобной категории лиц.

Восстановивший наследование Гражданский кодекс РСФСР 1922 г., определяя круг наследников по закону и завещанию, ограничил его прямыми нисходящими (детьми, внуками и правнуками) и пережившим супругом умершего, а также нетрудоспособными и неимущими лицами, фактически находившимися на полном иждивении умершего не менее одного года до его смерти (ст. 418). В ст. 420 Кодекса было установлено правило, согласно которому при наследовании по закону наследственное имущество делилось поголовно на равные доли между всеми наследниками, т.е. между супругом, нисходящими прямыми потомками и иждивенцами, т.е. все они наследовали одновременно.

В последующем в соответствии с Указом Президиума Верховного Совета СССР от 14 марта 1945 г. «О наследниках по закону и по завещанию» Президиум Верховного Совета РСФСР Указом от 12 июня 1945 г. внес изменения в Гражданский кодекс РСФСР, установив две очереди наследования. В первую были отнесены дети (в том числе усыновленные), супруг и нетрудоспособные родители умершего, а также другие нетрудоспособные, состоявшие на иждивении умершего не менее одного года до его смерти (ст. 418 ГК РСФСР). Законом было установлено, что если кто-либо из детей наследодателя умрет до открытия наследства, его наследственная доля переходила к его детям (внукам наследодателя), а в случае смерти последних — к их детям (правнукам наследодателя). Только в случае отсутствия указанных наследников или непринятия ими наследства к наследованию по закону призывались трудоспособные родители, а при их отсутствии — братья и сестры умершего. Таким образом, нетрудоспособные лица, состоявшие на иждивении умершего не менее одного года до его смерти, являясь наследниками первой очереди, отстраняли от наследования таких кровных родственников наследодателя, как трудоспособные родители, братья и сестры.

Законом от 8 декабря 1961 г. Верховный Совет СССР утвердил Основы гражданского законодательства Союза ССР и союзных республик и ввел их в действие с 1 мая 1962 г. <6>. В Основах было установлено, что при наследовании по закону наследниками первой очереди являются в равных долях дети (в том числе усыновленные), супруг и родители (усыновители) умершего (ст. 118). К числу наследников первой очереди также был отнесен ребенок умершего, родившийся после его смерти. Внуки и правнуки наследодателя являются наследниками по закону, если ко времени открытия наследства нет в живых того из их родителей, который был бы наследником. В Основах был сохранен принцип распределения наследуемого имущества, заложенный Указом 1945 г.: внуки и правнуки наследуют поровну в той доле, которая причиталась бы при наследовании по закону их умершему родителю. Нововведением Основ стал порядок наследования иждивенцами: нетрудоспособные лица, состоявшие на иждивении умершего не менее одного года до его смерти, при наличии других наследников наследуют наравне с наследниками той очереди, которая призывается к наследованию. Так иждивенцы получили статус «плавающих» наследников, т.е. переходящих от одной очереди к другой.

Принятый в развитие Основ гражданского законодательства Союза ССР и союзных республик Гражданский кодекс РСФСР 1964 г. установил, что при наличии у наследодателя других наследников по закону нетрудоспособные иждивенцы наследуют вместе с той очередью наследников, которая призвана к наследованию: при наличии наследников по закону первой очереди нетрудоспособный иждивенец призывался к наследованию вместе с наследниками первой очереди, если к наследованию призывались наследники второй очереди, нетрудоспособный иждивенец призывался к наследованию вместе с ними (ч. III ст. 532). Такой порядок наследования просуществовал до принятия Основ гражданского законодательства Союза ССР и республик 31 мая 1991 г., но в ст. 154 которых были сохранены общие принципы наследования по закону и определены только наследники первой очереди: дети (в том числе усыновленные), супруг и родители (усыновители) умершего.

Часть 3 Гражданского кодекса Российской Федерации (ГК РФ), содержащая раздел пятый «Наследственное право» и вступившая в действие с 1 марта 2002 г., установила новые правила наследования иждивенцами. Нетрудоспособных иждивенцев ГК РФ разделил на две группы. К первой группе относятся те из них, кто входит в круг наследников по закону (со второй по седьмую очередь), но не входит в круг наследников той очереди, которая призывается к наследованию, но призывается совместно с ними к наследованию благодаря факту нахождения на иждивении в течение не менее года до смерти наследодателя (п. 1 ст. 1148 ГК РФ). Во вторую группу иждивенцев включены лица, которые не входят в круг наследников по закону, но на момент смерти наследодателя они являлись нетрудоспособными и не менее одного года находились на его иждивении, проживая вместе с ним, благодаря чему наследуют вместе с наследниками той очереди, которая призывается к наследованию. При отсутствии у умершего других наследников по закону указанные нетрудоспособные иждивенцы наследодателя наследуют самостоятельно в качестве наследников восьмой очереди. Более того, и те и другие нетрудоспособные иждивенцы наследодателя согласно п. 1 ст. 1149 ГК РФ являются необходимыми (обязательными) наследниками, т.е. наследуют независимо от содержания завещания не менее половины доли, которая причиталась бы каждому из них при наследовании по закону (обязательная доля).

Давая общую оценку новелл ГК РФ по рассматриваемому вопросу, следует сказать, что законодатель, дополнив существовавшие ранее условия призвания иждивенцев к наследованию новыми условиями, тем самым ограничил круг этих лиц как потенциальных наследников по закону. При этом следует подчеркнуть, что ограничения наследования нетрудоспособными иждивенцами теперь распространяются и на наследование ими в порядке ст. 1149 ГК РФ в качестве необходимых наследников, имеющих право на обязательную долю. Нетрудоспособные иждивенцы, входящие в круг наследников любой из семи очередей, призываются к наследованию в соответствии со ст. 1149 ГК РФ, если не менее года до смерти наследодателя находились на его иждивении. Другие нетрудоспособные иждивенцы наследуют, если не менее года до смерти наследодателя не только находились на его иждивении, но и проживали совместно с ним. Гражданский кодекс РСФСР 1964 г. (ст. 535) не предусматривал ни одного из этих условий.

Основную цель наделения наследственными правами неимущих и нетрудоспособных иждивенцев доктрина первоначально видела в предоставлении своего рода социальной помощи, что должно было предотвратить утрату малоимущими и нетрудоспособными иждивенцами после смерти наследодателя того обеспечения и помощи, которыми они пользовались при его жизни, а также в освобождении государства от бремени содержания находившихся на иждивении наследодателя неимущих и нетрудоспособных лиц.

Наряду с социально-обеспечительной функцией наследования нетрудоспособных иждивенцев доктрина признавала и другие мотивы, оправдывавшие существование этого института, такие, как охрана интересов семьи наследодателя (в которую включались иждивенцы), что давало основание рассматривать законное наследование иждивенцев в качестве средства восполнения воли наследодателя.

Начнем с нетрудоспособности лица. Единого легального определения круга нетрудоспособных, используемого во всех случаях, когда с фактом нетрудоспособности связываются правовые последствия, нет. В различных законах с оговоркой для целей соответствующего закона приводимые перечни нетрудоспособных лиц не совпадают. Вопрос о трудоспособности в отечественном правопорядке традиционно относится к сфере законодательства о пенсионном обеспечении, определяющего условия назначения пенсии по инвалидности, по случаю потери кормильца или по старости. Цивилистическая доктрина выступает преимущественно за применение этих правил по аналогии в наследственном праве, в частности в отношении условий нетрудоспособности законных наследников.

Нетрудоспособными считаются, во-первых, лица, не достигшие возраста 18 лет (ст. 9 Федерального закона от 17 декабря 2001 г. «О трудовых пенсиях в Российской Федерации»). При этом продолжает действовать Постановление Пленума Верховного Суда СССР, разъясняющее, что применительно к наследственным отношениям к нетрудоспособным следует относить «лиц, не достигших 16, а учащихся — 18 лет».

В этих условиях господствующим в доктрине является мнение о необходимости придерживаться границ трудоспособности, выработанных судебной практикой. При этом Ю.К. Толстой последовательно выступает за отнесение по аналогии со ст. 1088 ГК РФ к нетрудоспособным лиц, не достигших 18 лет, а учащихся по очной форме обучения — до окончания учебы, но не более чем до 23 лет, «учитывая крайне тяжелое положение молодежи, особенно учащейся, а также высокий процент безработицы среди молодежи».

В то же время высказываются и возражения против выработанных судебной практикой критериев нетрудоспособности несовершеннолетних. М.Л. Шелютто, ссылаясь на пенсионное законодательство, делает вывод о неприменимости разъяснений Пленума Верховного Суда СССР (как противоречащих законодательству Российской Федерации) и отстаивает необходимость отнесения к нетрудоспособным всех несовершеннолетних, не достигших 18 лет, независимо от того, учатся они по достижении 16 лет в образовательных учреждениях или нет.

Действительно, в момент принятия указанных разъяснений Пленума Верховного Суда СССР они в части определения нижней границы трудоспособности несовершеннолетних совпадали с одним из условий предоставления пенсии по случаю потери кормильца, которая назначалась членам семьи умершего, не достигшим 16 лет (учащимся — 18 лет). Однако, давая соответствующее разъяснение, Пленум не ссылался на пенсионное законодательство. По мнению О.Ю. Шилохвоста, Пленумом была сформулирована норма, восполнявшая пробел в гражданском законе в части определения понятия нетрудоспособности как основания наследования иждивенцев. С этой точки зрения такое разъяснение представляло источник права, применимость которого могла быть поставлена под сомнение только в связи изменением понятия нетрудоспособности в той отрасли законодательства, применительно к которой Пленумом было дано соответствующее разъяснение. Поскольку ГК РФ понятие нетрудоспособности не было установлено, разъяснение высшей судебной инстанции не противоречит гражданскому законодательству, а значит, его применение не может ставиться под сомнение по мотивам «несоответствия законодательству Российской Федерации».

Поскольку справедливость требует отодвинуть нижнюю границу трудоспособности несовершеннолетних иждивенцев, дающей им право на наследование по закону, следует либо внести в гражданское законодательство понятие нетрудоспособности, либо продолжать традицию заимствования понятия нетрудоспособности из других отраслей законодательства, принять соответствующее разъяснение Пленума Верховного Суда РФ.

Во-вторых, к нетрудоспособным относятся лица, достигшие возраста (мужчины — 60 лет, женщины — 55 лет), дающего право на получение пенсии по старости независимо от состояния здоровья. Эти установленные пенсионным законодательством возрастные границы совпадали с предусмотренными Пленумом Верховного Суда СССР условиями наследования нетрудоспособных иждивенцев. Судебная практика и доктрина признавали одинаковые условия возрастной нетрудоспособности в качестве основания для наследования по закону для всех без исключения лиц, независимо от их права на получение пенсии по старости на льготных условиях, что свидетельствует о том, что эти условия (достижение 55 или 60 лет) приобрели свойство некой определенной объективной характеристики. А наличие такой характеристики позволяет говорить о наследовании нетрудоспособных иждивенцев уже не только как о квазисоциальном обеспечении, но и как об определенной мере восполнения законом предлагаемой воли наследодателя.

В-третьих, к нетрудоспособным относятся лица, имеющие право по состоянию здоровья на получение пенсии по инвалидности. Применительно к последней категории нетрудоспособных в зависимости от состояния здоровья, измененного болезнью или увечьем, были установлены три группы инвалидности, из которых к первой и второй относились лица, полностью утратившие трудоспособность как по своей, так и по какой бы то ни было другой профессии, а к третьей — лица, не способные к систематическому труду по своей профессии в обычных условиях для этой профессии, но которые могут использовать свою остаточную трудоспособность. В соответствии со ст. 8 Федерального закона от 17 декабря 2001 г. «О трудовых пенсиях в Российской Федерации» при назначении пенсии по инвалидности во внимание принимается не группа инвалидности, а степень ограничения способности к трудовой деятельности. Так что применительно к наследственным отношениям к нетрудоспособным следует относить лиц, признанных инвалидами при наличии ограничений способности к трудовой деятельности третьей, второй и первой степеней.

В период действия классификации по группам инвалидности долгое время дискуссионным оставался вопрос о включении в число наследников по признаку нетрудоспособности инвалидов третьей группы. Одни цивилисты выступали за безусловное отнесение указанных лиц к числу законных наследников, как обладавших лишь частичной трудоспособностью. Другие настаивали на отсутствии оснований для отнесения к числу нетрудоспособных инвалидов третьей группы, за которыми признавалась возможность подыскать себе подходящую работу. При всей очевидности последнего довода (лицо, сохранившее возможность обеспечения собственным трудом, не должно претендовать на получение содержания от других лиц), эта позиция сводила наследование иждивенцев к суррогату социального обеспечения. Только с позиций определения условий наделения инвалида правом на дополнительное обеспечение за счет наследства могло иметь значение частичное сохранение у такого инвалида трудоспособности. Если бы речь шла только о восполнении воли наследодателя, следовало бы признать достаточным одного только иждивения наследодателем соответствующего инвалида.

Окончательное разрешение вопроса о наследственных правах инвалидов третьей группы было дано Пленумом Верховного Суда СССР, разъяснившим, что «к нетрудоспособным следует относить инвалидов первой, второй и третьей групп, независимо от того, назначена ли данным лицам пенсия по старости или инвалидности». Таким образом, нетрудоспособность по состоянию здоровья стала общим объективным критерием, что получило безоговорочную поддержку доктрины. С устранением сомнений относительно наследственных прав инвалидов третьей группы наследование нетрудоспособных иждивенцев утратило еще одно условие, превращавшее его исключительно в суррогат социального обеспечения, для которого действительно может иметь значение сохранение у лица частичной или остаточной трудоспособности.

Еще одним немаловажным аспектом нетрудоспособности является то, что нетрудоспособность может быть как стойкой, так и временной. Судебная практика, поддержанная и теоретиками, идет по пути признания права на необходимое наследование только за лицами, имеющими стойкую нетрудоспособность. Однако такой подход не всегда оправдан. В частности, речь в данном случае может идти о случаях заболеваний и травм, когда по решению клинико-экспертной комиссии при благоприятном клиническом и трудовом прогнозе в отдельных случаях (травмы, состояния после реконструктивных операций, туберкулез) листок нетрудоспособности может быть продлен до полного восстановления трудоспособности, но на срок 12 месяцев. Как считает Ю. Харитонова, в законе целесообразно было бы специально предоставить суду право в отдельных случаях, например, устанавливать факт нетрудоспособности, не приводящей к инвалидности, но имеющей существенное значение для получения обязательной наследственной доли материально не защищенным лицом.

Указание о том, что к числу наследников по закону относятся нетрудоспособные лица, «состоявшие на иждивении умершего не менее одного года до его смерти» (ч. 1 ст. 418 ГК РСФСР 1922 г., в редакции 1945 г., ч. 3 ст. 532 ГК РСФСР 1964 г.), нередко воспринималось как требование, чтобы на иждивении находилось уже нетрудоспособное лицо, или, говоря иначе, как необходимость быть нетрудоспособным по крайней мере в течение года до дня открытия наследства. Судебная практика, однако, исходила из того, что для установления факта нахождения на иждивении необходимо, чтобы иждивенец «был нетрудоспособным ко дню открытия наследства». Указанные соображения во многом предопределили содержание действующего регулирования по этому вопросу: для обеих групп нетрудоспособных иждивенцев условие о нетрудоспособности не только текстуально отделено от условия о продолжительности иждивения, но и прямо снабжено оговоркой о том, что нетрудоспособность должна иметь место «ко дню открытия наследства» (п. 1 и 2 ст. 1148 ГК РФ).

Требование нетрудоспособности в таком контексте практически исключает влияние этого условия на волю наследодателя, для восполнения которой, как правило, возникает необходимость обращения к правилам о наследовании по закону. Ведь если наследодатель содержал в течение установленного срока какое-либо лицо, это лицо тем не менее получило наследственные права лишь при условии утраты на момент открытия наследства трудоспособности по достижении предельного возраста или по состоянию здоровья. Совершенно очевидно, что наследодатель, доставляя содержание такому лицу, никак не мог руководствоваться критериями нетрудоспособности такого иждивенца. Это, подчеркнем еще раз, явно указывает, что законное наследование иждивенцев, по крайней мере, судя по условиям его наступления, все еще остается суррогатом социального обеспечения.

Нетрудоспособность по возрасту устанавливается по паспорту, свидетельству о рождении и приравненным к нему документам. Нетрудоспособность по состоянию здоровья — на основании справки ВТЭК и ВЭК. Признание гражданина инвалидом, установление времени наступления и периода инвалидности, а также степени ограничения способности к трудовой деятельности и причины инвалидности осуществляются Государственной службой медико-социальной экспертизы. Порядок и условия признания гражданина инвалидом утверждаются Правительством Российской Федерации.

В отношении иждивения, т.е. предоставления содержания одним лицом другому лицу, в 1923 — 1945 гг. закон обусловливал призвание к наследованию неимущих и нетрудоспособных людей требованием, чтобы оно было, во-первых, фактическим, а во-вторых — полным. Исключение из закона требования фактического иждивения, подчеркивавшего наличие волеизъявления наследодателя, сделало весьма затруднительным отстаивание тезиса о предоставлении законных наследственных прав нетрудоспособным иждивенцам как способе восполнения предполагавшейся воли наследодателя. Невозможность законодательного обоснования приоритета воли наследодателя перед всеми иными возможными мотивами доставления им содержания своим иждивенцам превращала наследование нетрудоспособных иждивенцев исключительно в суррогат социального обеспечения, для которого действительно не имело решающего значения то обстоятельство, было ли предоставление содержания иждивенцу свободным волеизъявлением наследодателя или всего лишь исполнением возложенной на него обязанности по предоставлению средств к существованию строго определенному кругу лиц. Доктрина, во всяком случае, не придавала значения волеизъявлению наследодателя, подчеркивая, что для наследования в качестве нетрудоспособного иждивения не имеет значения, «выплачивалось ли содержание добровольно или на основании судебного решения».

Попытка учесть наличие обязанности содержать иждивенца при определении условий его призвания к наследованию по закону была предпринята в проекте части третьей ГК РФ. В проекте было заложено принятое впоследствии законодателем деление нетрудоспособных иждивенцев на две группы в зависимости от того, относились ли они к числу наследников по закону или не относились. Кроме того, проект предусматривал, что те из нетрудоспособных иждивенцев первой группы, кого наследодатель обязан был содержать, должны наследовать наравне с наследниками призываемой к наследованию очереди, а остальные иждивенцы из этой группы должны наследовать не более одной четверти наследства (абз. 2 п. 1 ст. 1192 проекта ГК РФ). Аналогичная квота — 1/4 наследства была предусмотрена (п. 2 ст. 1192 проекта ГК РФ) и для нетрудоспособных иждивенцев второй группы, правда, уже независимо от того, обязан ли был наследодатель их содержать. При этом нетрудоспособных иждивенцев предлагалось исключить из числа лиц, имевших право на обязательную долю в наследстве.

Таким образом, к имевшим законное право на доставление содержания от наследодателя иждивенцам предъявлялись более мягкие требования с предоставлением в то же время наследственных прав наравне с другими законными наследниками, что свидетельствовало о намерении разработчиков разделить наследование иждивенцев как суррогат социальной помощи и как меру восполнения воли наследодателя. К сожалению, предложенные проектом 1997 г. новеллы не получили поддержки в литературе и при обсуждении проекта. Они, прежде всего, рассматривались в контексте сужения наследственных прав иждивенцев, лишения их обязательной доли. Что касается объема наследственных прав иждивенцев, то эволюция этих прав после их признания в 1918 г. в нашем законодательстве проходила как раз под знаком их последовательного ограничения: до 1945 г. иждивенцы устраняли от наследования ближайших восходящих наследников завещателя, до 1964 г. они могли устранить от наследования уже только трудоспособных восходящих наследников. В то же время необходимо иметь в виду, что предлагавшееся ограничение — за счет квоты для иждивенцев, не имевших права требовать содержание, и введения для них дополнительного условия в виде совместного проживания, наконец, за счет лишения иждивенцев права на обязательную долю — сопровождалось беспрецедентным расширением круга законных наследников. В таких условиях большинство иждивенцев из числа кровных родственников получали наследственные права не в силу нетрудоспособности, иждивенства или совместного проживания, а непосредственно в силу кровного родства. Реальное ограничение, по существу, касалось только посторонних для наследодателя иждивенцев.

Отказ законодателя в 1945 г. от требований фактического и полного иждивения поставил перед доктриной и судебной практикой вопрос о выработке адекватных признаков и условий иждивения, необходимых для законного наследования. Предлагалось, в частности, относить к иждивенцам наследодателя только тех лиц, для которых материальная помощь с его стороны являлась «постоянным и основным источником существования». Требование о том, чтобы материальная помощь наследодателя являлась постоянным и основным источником существования иждивенца, было признано судебной практикой и стало одним из выделявшихся доктриной условий призвания соответствующего иждивенца к наследованию по закону.

Другое требование к материальной помощи также было выдвинуто судебной практикой и заключалось в систематическом характере предоставляемого иждивенцу содержания. Сложившаяся судебная практика получила вполне единодушное одобрение в литературе и стала вторым традиционно выделявшимся доктриной условием призвания соответствующего иждивенца к наследованию по закону. В связи с требованием систематичности и регулярности материальной помощи как признаков иждивенства особо выделялись случаи, формально подпадавшие под эти требования, однако не приводившие к признанию наследственных прав соответствующего лица. Речь прежде всего шла о платежах в возмещение вреда, которые не делали получателя законным наследником причинителя.

Упоминалось также об отсутствии иждивения в случае, когда систематические выплаты составляли вознаграждение за какую-либо работу или во исполнение договора пожизненного содержания с иждивением. Доктрина, однако, не давала теоретического объяснения случаев, когда систематические и регулярные платежи, даже являясь основным источником существования получателя, не приводили тем не менее к признанию за ним законных наследственных прав получателя. Дело же заключается в том, что отказ от придания юридического значения систематическим и регулярным платежам в возмещение вреда или по гражданско-правовому договору не мог основываться ни на чем ином, как на признании того обстоятельства, что наследодатель, выплачивая соответствующие средства (не только по принуждению, но и в добровольном порядке), вовсе не считал получателя настолько близким лицом, чтобы он мог претендовать на получение части его имущества в порядке наследования. Наследодатель в данном случае лишь выполнял гражданско-правовую обязанность, а вовсе не изъявлял намерения обеспечить соответствующее лицо и на случай своей смерти. Здесь мы сталкиваемся с такими мотивами отнесения иждивенцев к числу законных наследников, которые никак не могут быть объяснены с позиций социального обеспечения. Значит, правопорядок допускал наследование иждивенцев не только в качестве социально-обеспечительной меры, но и в качестве средства восполнения предполагаемой воли наследодателя при наследовании по закону. Возможно, последующий отказ судебной практики от требования «систематичности» содержания был призван как раз провести границу не только по периодичности самих платежей, но и по соотношению с другими имевшимися у иждивенца источниками средств к существованию.

Установленный законом (ст. 418 ГК РСФСР 1922 г., ст. 532 ГК РСФСР 1964 г., ст. 1148 ГК РФ) срок иждивения (не менее одного года до смерти наследодателя) первоначально оценивался в литературе только как средство «для избежания того, чтобы под видом таких иждивенцев наследство передавалось любым лицам по усмотрению умершего». Позднее он стал рассматриваться в качестве меры против предъявления наследственных претензий со стороны лиц, недостаточно близко стоящих к наследодателю и даже чужих наследодателю людей, случайно или эпизодически получивших помощь или материальную поддержку со стороны наследодателя.

В целом доктрина постепенно отходила от понимания наследования неимущих и нетрудоспособных иждивенцев исключительно как социальной помощи, для предоставления которой совершенно безразличны близость и родство соответствующего иждивенца по отношению к кормильцу, равно как и периодичность доставления прижизненных платежей. Акцент на моментах близости и родства свидетельствовал, как представляется, о том, что содержание иждивенцев постепенно становилось лишь одним из средств выявления намерений наследодателя, когда значение придавалось недействительной (наследодатель не смог или не захотел явным образом выразить волю), а предполагаемой его воле, для формализации которой критерии постоянства иждивения и семейной близости с иждивенцем подходили как нельзя лучше.

В свете рассмотрения выше соотношения между различными условиями наследования иждивенцев, одни из которых (срок) были направлены на восполнение воли наследодателя путем объективизации тех критериев, которые могли бы свидетельствовать о намерении обеспечить иждивенца на случай своей смерти, а другие (нетрудоспособность, а в 1923 — 1945 гг. еще и нуждаемость иждивенца) служили лишь оправданием права иждивенца на социальное обеспечение, интерес представляет условие о совместном проживании иждивенца с наследодателем. Оно было включено в ГК РФ в 2001 г. в качестве дополнительного условия предоставления наследственных прав нетрудоспособным иждивенцам, не являющимся наследниками первой-седьмой очередей (п. 2 ст. 1148 ГК РФ).

Введение этого условия рассматривается доктриной как свидетельство «семейной близости» иждивенца и наследодателя, что, как представляется, позволяет разумно предположить о намерении наследодателя предоставить совместно проживавшему с ним иждивенцу содержание и на случай своей смерти. Совершенно очевидно, что совместное проживание в таком понимании не может служить обоснованием для предоставления нетрудоспособному иждивенцу своего рода социального обеспечения, поскольку нетрудоспособность такого иждивенца — как главное основание для предоставления обеспечения — не может зависеть от места его проживания. В этом контексте как раз раздельное проживание может свидетельствовать о меньшей нуждаемости (с позиций социального обеспечения) иждивенца ввиду наличия у него, по крайней мере, жилой площади.

При обсуждении и целесообразности требования о совместном проживании с умершим как необходимом условии наследования (п. 2, 3 ст. 1148 ГК РФ) следует иметь в виду и то, что непроживание совместно с наследодателем нередко может объясняться неблагополучными жилищными условиями умершего, не позволявшими предоставить иждивенцу крышу над головой (нельзя забывать, что миллионы людей в России продолжают проживать в стесненных условиях и стоять в очереди как нуждающиеся в улучшении жилищных условий). Поэтому трудно обосновать установление дополнительного требования о совместном проживании иждивенца с наследодателем. Введение критерия совместного проживания критически оценивается многими учеными, которые считают неоправданным разделение иждивенцев на две группы. Заслуживают внимания возражения по поводу того, что считается недопустимой конкуренция наследственных прав отдельных родственников, ничего не знавших о наследодателе, и лиц хотя бы и чужих по крови, но не только близко знавших наследодателя, но и получавших от него содержание, по крайней мере в течение года. К сожалению, конкуренция неизбежна во всех случаях, когда основанием законного наследования будут какие-либо иные признаки, кроме близости родства. Вопрос заключается в том, какой степенью разумно ограничивается представление наследодателя о своей родне. И в какой степени такое родство уже не должно приниматься в соображение для наделения родственников наследственными правами?

Ранее действовавшее законодательство (ст. 532 ГК РСФСР 1964 г.) признавало наследственные права кровных родственников, как правило, до второй (внуки, братья, сестры, дед и бабка), редко — до третьей (правнуки) степени родства при безграничных наследственных правах посторонних лиц (иждивенцев), лишь бы они были нетрудоспособными и находились на содержании наследодателя не менее года до открытия наследства. Действующее законодательство впало в другую крайность, отдав безоговорочный приоритет кровному родству, так что родственники до пятой степени родства включительно наследуют, несмотря ни на какие дополнительные признаки, будь то проживание, нетрудоспособность или иждивение. Относящиеся к этим родственникам нетрудоспособные иждивенцы получают наследственные права преимущественно даже перед более близкими родственниками. Зато не входящие в число наследников первой-седьмой очередей нетрудоспособные иждивенцы получают право наследования только при условии совместного проживания.

Справедливость, безусловно, требует, чтобы наследственные права нетрудоспособных иждивенцев второй группы, т.е. не относящихся к числу кровных родственников наследодателя в достаточных для наследования степенях, дифференцировались в зависимости от того, с кровными родственниками какой степени они призываются к наследованию и делят поровну наследственное имущество наследодателя. При наличии наследников первой-третьей очередей наследственные права нетрудоспособных иждивенцев второй группы вполне разумно и справедливо оговорить теми условиями, которые содержатся сегодня в п. 2 ст. 1148 ГК РФ, т.е. в том числе и совместным проживанием. Что касается наследования нетрудоспособных иждивенцев наравне с наследниками четвертой-седьмой очередей, возможно, его не следовало бы оговаривать совместным проживанием или не требовать этого проживания непременно в течение года. Наконец, наследование нетрудоспособных иждивенцев в качестве восьмой очереди (т.е. при отсутствии предшествующих семи очередей), вероятно, вообще не следует связывать с совместным проживанием, считая достаточным признаком предполагаемой воли наследодателя содержание их не менее года до открытия наследства. В последнем случае признак совместного проживания должен быть исключен еще и потому, что иначе оказывается, что имущество будет передано государству в качестве выморочного даже при наличии лиц, которых наследодатель длительное время содержал, выразив тем самым волю на призвание их к наследованию. В отсутствие более близких наследников нет оснований для применения дополнительного критерия в виде совместного проживания, к которому закон прибегает для ограждения прав кровных родственников от притязаний совершенно посторонних лиц.

В законодательстве (п. 2 ст. 1148 ГК РФ) не перечислены обстоятельства, которые при необходимости доказывания факта проживания должны быть представлены в его подтверждение. В литературе высказываются две точки зрения. Сторонники одной считают, что совместное проживание не должно быть связано с выполнением каких-либо формальностей (регистрация по месту постоянного или временного проживания), и для призвания нетрудоспособного иждивенца к наследованию достаточно фактического его проживания в одном жилом помещении с наследодателем. Вторая точка зрения исходит из необходимости подтверждения факта совместного проживания иждивенца с наследодателем «документами об их регистрации на протяжении этого срока по одному месту жительства».

Стоит согласиться со второй точкой зрения, что фактическое проживание совместно с наследодателем в одном жилом помещении, т.е. проживание, не связанное с выполнением предусмотренных законодательством формальных требований, не может рассматриваться как свидетельство тех или иных намерений наследодателя, как и временное и кратковременное пребывание иждивенца у наследодателя. Для того чтобы проживание давало основание разумно предположить о намерении наследодателя обеспечить иждивенца и на случай своей смерти, это проживание должно быть проживанием юридическим, а не фактическим. Совместное проживание наследодателя с иждивенцем тогда лишь дает основание для призвания последнего к наследованию, когда такое проживание было надлежащим образом оформлено.

Обращаясь к опыту постсоветской кодификации наследственного права стран Содружества Независимых Государств и Балтии, следует заметить, что наследственное право, как никакое иное более, обусловлено национально-культурной традицией, поэтому наследственно-правовой статус иждивенцев в современном наследственном праве указанных стран существенно различается.

В Республике Беларусь, где с 1 июля 1999 г. вступил в действие новый Гражданский кодекс Республики Беларусь (далее — ГК РБ), сохранена такая категория наследников, как нетрудоспособные иждивенцы наследодателя. Граждане, относящиеся к числу наследников по закону одной из степеней родства, и нетрудоспособные к моменту открытия наследства, но не входящие в круг наследников той очереди, которая призывается к наследованию, наследуют вместе с наследниками этой очереди, если не менее года до смерти наследодателя находились на его иждивении, независимо от того, проживали ли они совместно с наследодателем. Такие лица (нетрудоспособные иждивенцы), призываемые к наследованию вместе с наследниками одной из предшествующих очередей, наследуют не более одной четвертой части наследства, однако если наследодатель был обязан по закону их содержать, то они наследуют наравне с наследниками этой очереди (п. 1 ст. 1063 ГК РБ). К числу наследников по закону относятся также граждане, которые не входят в круг наследников по закону, но к моменту открытия наследства являлись нетрудоспособными и не менее одного года находились на иждивении наследодателя и проживали совместно с ним. При наличии других наследников по закону они наследуют вместе с наследниками той очереди, которая призывается к наследованию, однако не более одной четвертой части наследства. И только при отсутствии у умершего других наследников указанные нетрудоспособные иждивенцы наследодателя наследуют самостоятельно в равных долях (п. 2 ст. 1063 ГК РБ).

Гражданский кодекс Украины (далее — ГК У), который вступил в действие с 1 января 2004 г., устанавливает, что в пятую очередь наследуют иждивенцы наследодателя, которые не были членами его семьи, но на момент открытия наследства являлись несовершеннолетними или нетрудоспособными и не менее чем пять лет получали от него материальную помощь, которая была для них единственным или основным источником средств к существованию (ч. 2 ст. 1265 ГК У). Если указанные лица проживали с наследодателем одной семьей не менее чем пять лет ко времени открытия наследства, то они наследуют в четвертую очередь (ст. 1264 ГК У). Следует заметить, что украинский законодатель предпринял очень справедливый шаг, установив, что физическое лицо, которое является наследником по закону последующих очередей, может по решению суда получить право на наследование вместе с наследниками той очереди, которая призывается, при условии, что оно на протяжении продолжительного времени опекало, материально обеспечивало, предоставляло другую помощь наследодателю, который вследствие старости, тяжелой болезни или увечья был в беспомощном состоянии (п. 2 ст. 1259 ГК У). Впервые в круг наследников по закону включены не только те, кто находился на иждивении наследодателя, но и те, кто предоставлял ему такое иждивение.

Особенность наследственно-правового статуса иждивенцев в Армении заключается в том, что Гражданский кодекс Республики Армения не произвел деление нетрудоспособных иждивенцев наследодателя в зависимости от включения их в число наследников по закону и их проживания совместно с наследодателем, как это сделано в российском законе. Гражданский кодекс Армении устанавливает, что к числу наследников по закону относятся нетрудоспособные лица, не менее одного года до смерти наследодателя находящиеся на его иждивении, которые при наличии других наследников по закону наследуют вместе с наследниками той очереди, которая призывается к наследованию (ст. 1220 ГК Армении).

Гражданский кодекс Грузии от 26 июня 1997 г. не воспринял опыт Модельного ГК СНГ, является результатом кодификации романо-германского правового типа, максимально отличной как от модельной, так и от советской. Гражданский кодекс Азербайджанской Республики от 28 декабря 1999 г. и Гражданский кодекс Туркменистана от 1 января 1999 г. практически во всем воспроизводят нормы ГК Грузии, за рядом некоторых исключений. Во всех трех указанных государствах нетрудоспособные лица, которые находились на иждивении наследодателя и не могут самостоятельно содержать себя, если они не упомянуты в завещании, вправе требовать содержание (алименты) из наследства. Размер суммы, подлежащей выплате в виде содержания, может быть уменьшен с учетом объема наследственного актива (ст. 1342 ГК Грузии, ст. 1156 Гражданского кодекса Туркменистана, ст. 1161 Гражданского кодекса Азербайджанской Республики). Таким образом, в данных государствах иждивенцы не являются наследниками по закону, но вправе требовать установления алиментных обязательств (прав) в отношении лиц, принявших наследство.

Гражданский кодекс Республики Казахстан от 1 июля 1999 г. в качестве наследников шестой очереди назвал нетрудоспособных иждивенцев наследодателя (ст. 1066 ГК Республики Казахстан). В ст. 1171 ГК Республики Таджикистан от 11 февраля 2005 г. определено, что нетрудоспособные лица, которые не менее одного года до смерти наследодателя находились на его иждивении и проживали совместно с ним, при наличии других наследников по закону наследуют вместе с наследниками той очереди, которая призывается к наследованию (п. 1 ст. 1170 Гражданского кодекса Республики Таджикистан). Согласно Гражданскому кодексу Республики Узбекистан от 29 августа 1996 г. (ст. 1139) и Гражданскому кодексу Республики Кыргызстан от 5 января 1997 г. (ст. 1146) нетрудоспособные иждивенцы наследодателя, если они не наследуют с наследниками первых четырех очередей, входят в пятую (последнюю) очередь наследников по закону.

В Молдове (Гражданский кодекс Республики Молдова от 6 июня 2002 г.) и прибалтийских государствах, где постсоветское развитие наследственного права пошло по пути либо восстановления ранее действовавшего законодательства (Гражданский закон Латвийской Республики 1937 г.), либо рецепции германского права (Закон Эстонии от 15 мая 1996 г. «О наследовании», Гражданский кодекс Республики Литвы от 18 июля 2000 г.), возможности наследования для нетрудоспособных иждивенцев не предусмотрено, что отвечает общей традиции романо-германского наследственного права.

Итак, введение нетрудоспособных иждивенцев в круг наследников по закону первоначально доктрина расценивала в качестве предоставления им социальной помощи, а также как освобождение государства от бремени содержания данной категории граждан. На современном же этапе развития данного института требуются дополнительные нововведения, которые устранили бы коллизии при наследовании нетрудоспособными иждивенцами. Первоочередной мерой в данном направлении следует считать принятие высшей судебной инстанцией разъяснения, подтверждающего независимость критериев нетрудоспособности в наследственном праве от аналогичных критериев в новом пенсионном законодательстве. Следующим шагом должна стать выработка гражданско-правового понятия нетрудоспособности как критерия для предоставления соответствующим лицам определенных гражданских прав в упрощенном порядке или на льготных условиях по сравнению с лицами, возраст и состояние здоровья которых позволяют им самостоятельно защищать свои права и обеспечивать свое существование. Последовательное развитие института наследования иждивенцев, основанного на восполнении разумно предполагаемой воли наследодателя, должно с неизбежностью привести к отказу от условия нетрудоспособности в том виде, как оно понимается сегодня доктриной и закрепляется в законе.

Авторы — Блинков О.Е., доцент, кандидат юридических наук, Борисова Е.Н., соискатель кафедры гражданского права и процесса юридического факультета Коломенского государственного педагогического института.

Вы можете пропустить чтение записи и оставить комментарий. Размещение ссылок запрещено.

Несовершеннолетний и нетрудоспособный: кого нельзя лишить наследства

Институт обязательной доли в наследственном праве защищает интересы социально уязвимых категорий граждан. Несовершеннолетние дети и нетрудоспособные супруг, родители, дети, иждивенцы  наследодателя не могут быть лишены наследства, даже если наследодатель выразил такую волю в своем завещании.

Выделение обязательной доли – один из самых сложных вопросов в нотариальной практике. И нотариусы, принимая решение, часто сталкиваются с недостаточным пониманием всех юридических тонкостей наследственного права со стороны граждан. К примеру, многие наследники, претендующие на обязательную долю, полагают, что имеют право на выделение таковой из всей наследственной массы, как незавещанной, так и завещанной, или считают себя иждивенцами только потому, что получали время от времени некоторые суммы от наследодателя. Между тем, закон регулирует эти вопросы достаточно четко и решения нотариуса опираются на положения Гражданского кодекса и принятую методику расчета.

В Московской городской нотариальной палате регулярно проходят лекции и круглые столы для представителей нотариального сообщества столицы, где положения наследственного права рассматриваются применительно к разным жизненным ситуациям. Очередной тренинг был организован Советом молодых нотариусов для сотрудников нотариальных контор. Спикером мероприятия выступила нотариус г. Москвы Татьяна Ништ.

При открытии наследственного дела нотариус устанавливает круг наследников, в том числе претендующих на обязательную долю в наследстве. При этом несовершеннолетние дети наследодателя независимо от  их эмансипации или нахождения в браке до своего 18-летия  имеют право на обязательную долю. К категории нетрудоспособных, согласно Постановлению Пленума Верховного Суда РФ № 9 от 29 мая 2012 года, относятся инвалиды всех групп. Кроме того, право на обязательную долю в наследстве имеют родители, дети или супруги наследодателя, достигшие возраста 55 лет (для женщин) или 60 лет (для мужчин).

Обстоятельства, с которыми связывается нетрудоспособность гражданина, определяются на день открытия наследства.

Находившимся на иждивении наследодателя может быть признано лицо, получавшее от умершего в период не менее года до его смерти — вне зависимости от родственных отношений — полное содержание или такую систематическую помощь, которая была для него постоянным и основным источником средств к существованию, независимо от получения им собственного заработка, пенсии, стипендии и других выплат. При оценке доказательств, представленных в подтверждение нахождения на иждивении, оценивается соотношение оказываемой наследодателем помощи и других доходов нетрудоспособного. Но выносить такую оценку может только суд.

Право на обязательную долю не может быть поставлено в зависи­мость от согласия других наследников на ее получение и не переходит к наслед­никам по наследственной трансмиссии.

Информацию о круге лиц,  имеющих право на обязательную долю, нотариус получает при принятии заявлений от других наследников и исходя из документов с места жительства наследодателя. Нотариус в этом случае информирует  обязательных наследников об их правах.

Если обязательный наследник не заявил о своем желании принять наследство или отказаться от него, но нотариус из документов, поступивших к нему, понимает, что имеет место быть фактическое принятие им наследства, то такой наследник признается фактически принявшим наследство.

Наследник может отказаться от обязательной доли, но он не может при этом сделать направленный отказ в пользу кого-либо из наследников. При оформлении такого отказа  наследник не лишается права наследовать по закону в качестве наследника соответствующей очереди. Вместе с тем, принявший обязательную долю наследства человек, не вправе отказываться от части наследства, которое причитается ему по закону.

Размер обязательной доли в первую очередь зависит от момента составления завещания. Если последняя воля умершего была оформлена до 1 марта 2002 года, то применяются правила, установленные статьей 535 Гражданского кодекса РСФСР, и размер обязательной доли должен составлять не менее двух третей доли, которая причиталась бы обязательному наследнику при наследовании по закону.

К завещаниям, совершенным после 1 марта 2002 года, применяются правила об обязательной доле, установленные ст. 1149 ГК РФ — не менее половины доли, которая причиталась бы обязательному наследнику при наследовании по закону.

Большей сложностью отличается порядок исчисления обязательной доли в случаях, когда у наследодателя кроме завещанного имеется еще и незавещанное имущество.

Для расчета обязательной доли в этом случае необходимо знать:

— количество наследников по закону, призываемых к наследованию;

— состав наследственного имущества, как завещанного, так и незавещанного;

— реальную рыночную стоимость наследственного имущества.

Согласно п. 2 ст. 1149 ГК РФ, право на обязательную долю в наследстве удовлетворяется из оставшейся незавещанной части наследственного имущества, даже если это приведет к уменьшению прав других наследников по закону на эту часть имущества, а при недостаточности незавещанной части имущества для осуществления права на обязательную долю — из той части имущества, которая завещана. Согласно п. 3 той же статьи, в обязательную долю засчитывается все, что наследник, имеющий право на такую долю, получает из наследства по какому-либо основанию, в том числе стоимость установленного в пользу такого наследника завещательного отказа.

Если стоимость получаемого обязательным наследником имущества больше или равна стоимости обязательной доли, обязательная доля не выделяется и дополнительных расчетов не требуется.

В любом  случае наследники должны ознакомится с произведенным нотариусом расчетом, выразить свое согласие с ним. При возникновении спора решение по наследственному делу вправе вынести только суд.

 

границ | АДФ-зависимые киназы архей отряда Methanosarcinales адаптируются к соли с помощью неканонической эволюционно консервативной стратегии

Введение

Галофильные организмы — это организмы, обитающие в сложных осмотических условиях, соленость которых варьируется от умеренной до экстремальной, где соли достигают предела своей растворимости. Эти организмы присутствуют в трех сферах жизни, объединяясь в четко определенные филогенетические группы (Oren, 2008; Weinisch et al., 2018).У архей галофильные организмы были идентифицированы в типе Euryarchaeota , где они представлены в трех филогенетических группах; Nanohaloarchaea (пока еще некультивируемая группа организмов) (Narasingarao et al., 2012), Halobacteria и Methanosarcinales (Oren, 2008). Хотя организмы из Halobacteria и Methanosarcinales демонстрируют разные фенотипы, они были признаны филогенетически родственными (Burggraf et al., 1991). Halobacteria является крупнейшим филогенетическим классом в Euryarchaeota и из-за высокой солености, необходимой для его роста, стала классической моделью для исследований галофильной адаптации (Larsen, 1967; DasSarma and DasSarma, 2015). За некоторыми исключениями, эти аэробные организмы не могут расти при солености ниже 3 M NaCl и процветать при ее предельных значениях (5 M NaCl). Поскольку эта экстремальная среда создает большое осмотическое давление, Halobacteria разработали механизм противовеса, чтобы выжить за счет накопления до 4 ионов MK ⁺ и Cl ^— в их цитозоле (Christian and Waltho, 1962; Youssef et al. ., 2014). Эволюционное давление также привело к появлению уникальных модификаций молекулярного механизма этих организмов. Например, наличие предвзятого аминокислотного состава в белках из Halobacteria (Reistad, 1970; Lanyi, 1974) было признано более 50 лет назад. Эти модификации основаны на взаимодействии следующих стратегий: (i) увеличение содержания кислотных остатков (Asp и Glu) вместе с уменьшением содержания Lys, что приводит к отрицательно заряженной молекулярной поверхности, которая составляет наиболее заметную особенность белков из Halobacteria , (ii) уменьшение Lys также приводит к уменьшению гидрофобной области, подверженной воздействию растворителя, и (iii) уменьшение общего содержания крупных гидрофобных остатков (Ile, Leu, Phe, Met) и сопутствующее предпочтение меньших остатков, таких как Ala и Val, приводящее к уменьшению объема гидрофобного ядра (Paul et al., 2008; Грациано и Мерлино, 2014; Нат, 2016).

Хотя заказ Methanosarcinales включает галофильные организмы, стратегии, ответственные за адаптацию белков к высоким концентрациям соли в этих организмах, еще предстоит решить. С точки зрения потребности в солях эти анаэробные организмы более универсальны, чем Halobacteria , поскольку они растут в средах с соленостью от 0 до 5 M NaCl и, следовательно, также включают негалофильные организмы.Чтобы приспособить свое осмотическое давление к разной солености, организмы из Methanosarcinales используют механизм смешанного осмотического противовеса, основанный на накоплении неорганических ионов (до 3 MK ⁺ у большинства галофильных организмов) (Lai and Gunsalus, 1992) и внутриклеточное накопление нескольких небольших органических молекул, называемых осмолитами, известное как стратегия «совместимых растворенных веществ» (Lai et al., 1991). Среди используемых осмолитов глицин бетаин является одним из тех, которые преимущественно накапливаются организмами, населяющими наиболее соленую среду (Lai et al., 1991).

До сих пор не было сообщений о механизме галофильной адаптации, встречающейся в белках из Methanosarcinales . Учитывая их тесную филогенетическую связь с Halobacteria , было бы интересно спросить, разделяют ли обе группы общую стратегию или белки из Methanosarcinales эволюционировали по-другому. С другой стороны, поскольку порядок Methanosarcinales включает как галофильные, так и негалофильные организмы, было бы также интересно определить, является ли галофильный признак наследственным или представляет собой эволюционную новизну.

Чтобы ответить на эти вопросы, мы взяли АДФ-зависимые сахарные киназы из Methanosarcinales в качестве модельной системы. Эти ферменты принадлежат к суперсемейству рибокиназ и катализируют фосфорилирование глюкозы или фруктозо-6-фосфата, используя АДФ в качестве донора фосфорила при гликолизе, центральном пути производства энергии. Некоторые члены суперсемейства являются субстрат-специфическими для глюкозы или фруктозы-6P (GK-ADP или PFK-ADP), тогда как другие являются бифункциональными ферментами (PFK / GK-ADP).Недавно было сообщено, что ферменты из Methasanosarcinales, которые были аннотированы как АДФ-специфичные, на самом деле являются бифункциональными и, следовательно, способны катализировать фосфорилирование обоих субстратов (Zamora et al., 2017). Путем сочетания биоинформатики и экспериментальных подходов наряду с реконструкцией предковых ферментов мы определили структурные свойства, которые определяют галофильный характер этих белков и эволюционную траекторию этого признака.

Материалы и методы

Модели гомологии белков и структурные анализы

Последовательности

для моделирования гомологии АДФ-зависимых сахарных киназ из Halobacteria, Methanosarcinales и Eukarya были получены из баз данных UniProt и NCBI (дополнительная таблица S1).Построенные модели были разделены на четыре группы на основе таксономической категоризации исходного организма и их способности расти в условиях высокой солености, как сообщается в литературе. Были определены следующие группы: Halobacteria , галофильные Methanosarcinales , негалофильные Methanosarcinales и Eukarya , последняя использовалась в качестве контрольной внешней группы. В каждой группе использовали шесть последовательностей, за исключением галофильного Methanosarcinales , для которого доступно только пять последовательностей.Гомологические модели для ферментов архей были построены с использованием четырех шаблонных структур; ADP-GK из Thermococcus litoralis (PDB: 4B8R), ADP-GK и ADP-PFK из Pyrococcus horikoshii (PDB: 1L2L и 1U2X, соответственно) и последний общий предок Methanococles и Thermococcales (PDB: 5K27). Для ферментов Eukaryotic использовали две матрицы; ADP-GK из T. litoralis и ADP-GK из Mus musculus (PDB: 5CCF).Поскольку эукариотические белки имеют вставку, образующую N-концевой спиральный домен (Richter et al., 2016), моделировалась только гомологичная область, содержащая каталитический домен. Пятьдесят моделей для каждого белка были созданы с использованием Modeller v9.15 (Eswar et al., 2008) и оценены на основе потенциала DOPE. После визуального осмотра лучших моделей модели с аномальными конфигурациями контуров были уточнены с помощью сервера GalaxyWEB (Ko et al., 2012). Качество полученных моделей оценивалось с помощью ProSA-web (Wiederstein and Sippl, 2007), Procheck (Laskowski et al., 1993) и Verify3D (Eisenberg et al., 1997). Лучшие созданные модели были подвергнуты минимизации энергии с использованием стандартного протокола в NAMD с силовым полем CHARMM27 для дальнейшего анализа (Phillips et al., 2005).

Чтобы оценить распределение остатков по различным структурным моделям, площадь молекулярной поверхности каждого остатка была определена с использованием веб-сервера WHAT-IF (Vriend, 1990). Остатки были разделены на две категории в зависимости от их доступной площади поверхности; если это было ≥5 Å ² , остаток считался обнаженным на поверхности (внешняя оболочка) (дополнительная таблица S2), в противном случае считалось, что он погребен внутри белкового ядра (внутренняя оболочка) (дополнительная таблица S3).Существование статистически значимых различий оценивали с помощью теста Краскела-Уоллиса в сочетании с апостериорным тестом Данна . Полярная и заряженная доступная площадь поверхности определялась с помощью веб-сервера VADAR (Willard et al., 2003). Поверхности электростатического потенциала репрезентативных моделей были созданы с помощью плагина APBS Tools для PyMOL.

Вывод филогении и реконструкция последовательности предков

Наследственная последовательность последнего общего предка ферментов Methanosarcinales была выведена с использованием иерархического байесовского метода (Huelsenbeck and Bollback, 2001) с использованием CpREV в качестве эволюционной модели.Выравнивание всех последовательностей из ADP-зависимого семейства (120 последовательностей в январе 2015 г.) и обновленное выведенное филогенетическое дерево показано на дополнительном рисунке S1. Анализ был проведен с 10 ⁷ поколениями и частотой выборки 1000. Из полученных 20 000 деревьев 40% были отброшены на этапе приработки и, наконец, 12 000 деревьев были использованы при вычислении апостериорных вероятностей. Для каждой позиции выравнивания выбирали остаток с наивысшей апостериорной вероятностью (PP).Полученную последовательность скорректировали на наличие пропусков по методу Холла (Hall, 2006), получив конечную последовательность из 490 аминокислотных остатков. Эту последовательность проверяли на наличие консервативных мотивов и каталитических остатков, все из которых присутствовали с апостериорной вероятностью, равной 1,0. Распределение вероятностей предполагаемой наследственной последовательности показано на дополнительном рисунке S2.

Экспрессия и очистка белка

АДФ-зависимая фосфофруктокиназа (PFK) из Methano halobium evestigatum (MevePFK / GK) очищали, как описано ранее (Zamora et al., 2017). ПФК из Methanosarcina mazei (MmazPFK / GK) очищали следующим образом: клеток Escherichia coli C41 трансформировали плазмидой pET-15b, несущей de novo и кодон-оптимизированный ген для последовательности белка MmazPFK / GROKT. code: Q8PZL9), включая поли-гистидиновую метку на N-конце и устойчивость к ампициллину. Ночную культуру этих клеток использовали для инокуляции 4 л потрясающего бульона, содержащего 100 мкг мл ^-1 ампициллина.Экспрессию белка индуцировали при OD 0,6 с помощью 0,5 мМ IPTG. Клетки выращивали в течение ночи при 30 ° C, а затем среду центрифугировали при 8000 g в течение 10 минут для получения осадка клеток, который суспендировали в буфере для лизиса (1 М NaCl, 25 мМ Трис, pH 7,8, 5 мМ MgCl _{. 2} , 1 мМ PMSF) и разрушили обработкой ультразвуком при 4 ° C. Этот объем центрифугировали при 15000, г, в течение 20 минут для удаления клеточного дебриса и полученный супернатант нагревали при 50 ° C в течение 30 минут. Этот объем снова центрифугировали при 15000 г в течение 20 минут для удаления денатурированного белка, и полученный супернатант загружали в колонку 5 мл Ni ⁺² -NTA (GE-Healthcare).Белок элюировали линейным градиентом имидазола от 20 до 300 мМ (25 мМ Tris pH 7,8 и 500 мМ NaCl). Фракции с АДФ-зависимой киназной активностью объединяли и диализовали против 1 л буфера (20 мМ Tris pH 8,2, 100 мМ NaCl). Диализованный белок загружали в анионообменную колонку HiTrap-Q (GE-Healthcare) и элюировали линейным градиентом от 100 до 1000 мМ NaCl. Фракции с ферментативной активностью объединяли и диализовали против буфера (25 мМ Tris pH 8,2, 300 мМ NaCl и 5 мМ MgCl ₂ ).

Для последнего общего предка PFK из Methano sarcinales (AncMsPFK / GK) последовательность гена была оптимизирована по кодонам для экспрессии в E. coli и синтезирована с помощью GENSCRIPT (Пискатауэй, штат Нью-Джерси, США), клонирован в pET-15. BL21 Клетки E. coli трансформировали вектором экспрессии и культивировали в 1 л среды LB со 100 мкг мл ^-1 ампициллина до достижения OD ₆₀₀ , равного 0,6. Экспрессию белка индуцировали с использованием 1 мМ IPTG в течение ночи при 37 ° C.Клетки центрифугировали (8000 г в течение 15 мин при 4 ° C) и суспендировали в буфере для лизиса (25 мМ Tris HCl pH 7,8, 20 мМ имидазол, 1 М NaCl и 5 мМ MgCl ₂ ). Затем клетки разрушали ультразвуком (12 импульсов по 20 с, с амплитудой 40% и интервалом 1 мин), и полученный лизат центрифугировали (15000 г в течение 20 минут при 4 ° C). Супернатант нагревали при 80 ° C в течение 20 минут и денатурированные белки удаляли центрифугированием (15000 г в течение 20 минут при 4 ° C).Супернатант фильтровали и загружали в колонку High Performance Ni ⁺² -Sepharose 5 мл (GE Healthcare), уравновешенную буфером A (25 мМ Tris HCl pH 7,8, 20 мМ имидазол, 500 мМ NaCl и 5 мМ MgCl _2). ). Белок элюировали линейным градиентом от 20 до 200 мМ имидазола в том же буфере. Активные фракции объединяли и диализовали против буфера для хранения белка (25 мМ Tris HCl pH 7,8, 300 мМ NaCl, 5 мМ MgCl ₂ и 50% глицерин) и хранили при -80 ° C.

Измерения активности ферментов

PFK и GK ADP-зависимые активности определяли, как сообщалось ранее (Kengen et al., 1994). Вкратце, активность GK определяли после восстановления NAD ⁺ при 340 нм в сочетании анализа с 10-13 единицами G6PDH из Leuconostoc mesenteroides , который был гетерологично экспрессирован в E. coli и очищен в нашем лаборатория. Анализ также содержал 25 мМ HEPES pH 7,8 и 0,5 мМ NAD ⁺ .Активность PFK-ADP измеряли путем окисления NADH при 340 нм в сочетании со следующими вспомогательными ферментами: α-глицерин-3-фосфатдегидрогеназа (5 единиц), триозофосфатизомераза (50 единиц) и альдолаза (1,3 единицы). ) все из мышц кролика (Sigma-Aldrich) вместе с 25 мМ PIPES pH 6,5 и 0,2 мМ NADH. Все определения активности фермента проводили при 40 ° C, а удельную активность рассчитывали на основе данных начальной скорости. За единицу активности фермента (U) принимали конверсию 1 мкмоль субстрата в минуту.Кинетические параметры активностей PFK и GK-ADP определяли, варьируя концентрацию одного субстрата при фиксированной и насыщающей концентрации вспомогательного субстрата. Определенные начальные скорости были скорректированы либо по уравнениям Михаэлиса-Ментен, либо по уравнениям ингибирования субстратом с помощью нелинейной регрессии.

Определение активности глюкокиназы в присутствии соли

Активность

GK-ADP была выбрана для мониторинга эффектов NaCl и KCl на активность MevePFK / GK и MmazPFK / GK, поскольку вспомогательный фермент, используемый в непрерывном анализе GK-ADP, не ингибируется высокими концентрациями этих солей.Для обоих ферментов реакционная смесь содержала насыщающие концентрации субстратов глюкозы и Mg-ADP (в соответствии с кинетической характеристикой каждого фермента), 25 мМ HEPES pH 7,8, 0,5 мМ NAD ⁺ и 40 единиц / мл G6PDH.

Определение активности фосфофруктокиназы в присутствии соли

Для оценки влияния солей на активность AncMsPFK / GK PFK использовали прерывистый анализ, поскольку вспомогательные ферменты непрерывного анализа PFK-ADP ингибируются концентрациями NaCl выше 300 мМ.Активность фермента определяли при 40 ° C в инкубационной смеси, содержащей 25 мМ Pipes pH 6,5, 15 мМ MgCl ₂ , 3 мМ фруктозы-6P, 10 мМ ADP и 0,004 U AncMsPFK / GK в конечном объеме 0,20. мл. Реакцию останавливали добавлением хлорной кислоты до конечной концентрации 3,7% об. / Об. Раствор охлаждали на льду в течение 5 мин и нейтрализовали добавлением бикарбоната натрия. Затем образец центрифугировали при 18000 g и 4 ° C в течение 10 минут, после чего выделяли растворимую фракцию.Продукт реакции PFK-ADP, фруктозо-1,6-бисфосфат, количественно определяли спектрофотометрическим титрованием до конечной точки, следуя окислению NADH при 340 нм. По существу, реакционная смесь для титрования содержала 50 мМ Pipes pH 6,5, 0,2 мМ NADH, 5 ед. Α-глицерофосфатдегидрогеназы, 50 ед. Триозофосфат-изомеразы и 1,3 ед. Альдолазы в конечном объеме 0,50 мл. Влияние KCl на активность AncMsPFK / GK PFK не анализировалось из-за влияния этой соли на реакцию гашения.

Термическая стабильность

Термостабильность белка анализировали путем отслеживания содержания вторичной структуры в спектрополяриметре Jasco J-1500, оборудованном системой Пельтье (PTC-517), с использованием кюветы с длиной пути 1 мм. Использовали концентрации белка от 2 до 5 мкМ, и образцы готовили в 20 мМ натрий-фосфатном буфере, pH 7,8, при различных концентрациях KCl или глицинбетаина. За изменением сигнала КД наблюдали при 222 нм с линейным изменением температуры 1 ° С / мин.

Анализ кинетической стабильности

Белки инкубировали в 20 мМ буфере HEPES pH 7,0 и различных концентрациях KCl (0, 0,1, 1 и 2 М) при конечной концентрации белка в диапазоне от 0,02 до 0,03 мг / мл ^-1 . Растворы MevePFK / GK / GK и MmazPFK / GK / GK инкубировали при 40 ° C, но, учитывая их термофильный характер, анализ AncMsPFK / GK проводили при 60 ° C. В моменты времени, указанные на фиг. 6, отбирали образцы и центрифугировали (13000 × г в течение 20 минут) для удаления денатурированного белка.Для трех ферментов активность PFK-ADP отслеживали на микропланшет-ридере при 30 ° C (Sinergy 2, Biotek) с использованием реакционного объема 250 мкл и насыщающих концентраций субстрата.

Рентгеновская кристаллография

Очищенные MeveFK / GK, MmazPFK / GK и ancMsPFK / GK были первоначально проверены на условия кристаллизации с коммерческими наборами с использованием робота-кристаллизатора ARI Gryphon (Arts Robbins Instruments LLC) методом диффузии пара сидя. Предварительные кристаллы были получены только для ancMsPFK / GK с использованием набора реагентов PEGrx (Hampton Research Corp), что привело к последующим раундам оптимизации.Кристаллы хорошего качества получали с использованием капли 1 мкл белка (10 мг / мл ^-1 , 2,5 мМ АДФ, 200 мМ NaCl, 7,5 мМ MgCl ₂ , 25 мМ HEPES, pH 7,8 и 1 мМ 2-меркаптоэтанола. ) и 1 мкл резервуарного раствора, содержащего 20 мМ CdCl ₂ , 20 мМ MgCl ₂ , 20 мМ NiCl ₂ , 24% PEG MME 2000 и 100 мМ ацетат натрия, и pH 4,5. Кристаллы появлялись через 2 недели при 19 ° C и были погружены в криозащитный раствор, состоящий из раствора для кристаллизации плюс 25% PEG 400, и мгновенно замораживались в жидком азоте.Данные дифракции рентгеновских лучей собирали при 100 К на канале MX2 в Бразильской лаборатории синхротронного света (LNLS Campinas-SP) с использованием детектора PILATUS 2M (Dectris Ltd.) и длины волны рентгеновского излучения 1,459 Å. Данные были проиндексированы, интегрированы и масштабированы с помощью XDS (Kabsch, 2010) и объединены с использованием Aimless из пакета CCP4 (Evans and Murshudov, 2013). Фазы были решены путем молекулярного замещения Молрепом (Вагин, Тепляков, 2010) с использованием структуры предковой АДФ-зависимой киназы (PDB ID 5K27; Castro-Fernandez et al., 2017) разделены на малые и большие домены в качестве поисковых моделей. Структура уточнялась с использованием Phenix (Adams et al., 2010) и COOT (Emsley, Cowtan, 2004). Ионы АДФ, воды, магния и никеля помещали с помощью COOT и уточняли с помощью ионных ограничений в Phenix. Полная статистика сбора и уточнения данных представлена ​​в таблице 2.

Результаты

Филогенетический анализ ферментов

Methanosarcinales

Чтобы охарактеризовать распределение ферментов ADP-PFK / GK, присутствующих в порядке Methanosarcinales , мы извлекли депонированные последовательности из неизбыточной базы данных и обновили предыдущее филогенетическое дерево, указанное для того же семейства белков (Zamora et al. ., 2017). Как показано на рисунке 1, ADP-PFK / GK присутствуют во всех организмах из Methanosarcinales , секвенированных на сегодняшний день (всего 13), и охватывает виды, обитающие в окружающей среде от 0 до 5 M NaCl (дополнительная таблица S1).

РИСУНОК 1. Филогенетические отношения между Euryarchaeota ADP-зависимыми киназами. (A) Филогенетическое дерево максимального правдоподобия для АДФ-зависимых киназ из секвенированных организмов. Цвета представляют разные филогенетические группы.Указаны значения теста отношения правдоподобия для каждого узла. (B) Схема семейства Methanosarcinales ADP-зависимых киназ. В скобках указана оптимальная молярная концентрация NaCl для роста каждого организма. N.D. означает «не определено». Самый галофильный организм группы ( M. evestigatum ) выделен синим цветом, негалофильный организм ( M. mazei ) — черным, а последний общий предок группы (ancMs) — красным. М.zhilinae способен выращивать до 2,5 М NaCl, поэтому он был включен в состав галофильных организмов.

Предполагаемое дерево (рисунок 1 и дополнительный рисунок S1) показывает, что Halobacteria и Methanosarcinales являются тесно связанными филогенетическими группами. Топология группы Methanosarcinales показывает, что большинство ADP-PFK / GK из негалофильных организмов объединяются в группу A. Однако два (из Methanococcoides burtonni и Methanococcoides methylutens ) филогенетически более тесно связаны с от галофильных организмов ( Methanohalobium evestigatum, Methanohalophilus mahii, Methanosalsum zhilinae, Methanohalophilus halophilus и Methanohalophilus portucalensis ) и входят в группу B.Присутствие этих двух групп согласуется с предыдущими филогенезами, о которых сообщалось для Methanosarcinales организмов (Liu, 2010). Учитывая филогенетическую близость Halobacteria и Methanosarcinales и присутствие галофильных организмов в обеих группах, возникает интересный вопрос, все ли такие белки адаптированы к высоким концентрациям соли с помощью общей стратегии. Кроме того, учитывая, что отряд Methanosarcinales включает как галофильные, так и негалофильные организмы, мы оценили, является ли галофильный характер сохраняющимся или возникающим в ходе эволюции признаком.

Анализ аминокислотного состава

Для оценки структурных адаптаций, присутствующих в ферментах из Methanosarcinales , мы построили модели гомологии и оценили состав и распределение остатков для белков галофильных и негалофильных организмов. Эти данные сравнивали с моделями, созданными для ферментов из Halobacteria и Eukarya , которые служили контролем для чрезвычайно галофильных и негалофильных белков, соответственно.Среднее содержание аминокислот показано на рисунке 2 (дополнительные таблицы S2, S3). На каждом графике результаты для Halobacteria и как галофильных, так и негалофильных белков Methanosarcinales всегда сравниваются с результатами, полученными для белков из Eukarya . АДФ-ПФК из Halobacteria демонстрируют классическое распределение аминокислот, описанное для белков этого филогенетического класса (Fukuchi et al., 2003; Paul et al., 2008). Внутренняя оболочка белков Halobacteria характеризуется увеличением небольшого остатка Ala (70% по сравнению с Eukarya ) и уменьшением крупных гидрофобных остатков, таких как Ile, Met, Leu, Phe и Trp (22, 20, 20, 49 и 69% соответственно) (рис. 2А).Интересно, что нет значительных различий между внутренними оболочками белков галофильных и негалофильных организмов Methanosarcinales (рис. 2В). Тем не менее, когда это распределение сравнивается с распределением, наблюдаемым для внутренней оболочки белков из Eukarya , ни одна из групп Methanosarcinales не показывает увеличения содержания малых гидрофобных остатков, а, скорее, значительного увеличения содержания больших гидрофобных остатков. гидрофобный остаток Ile (97% для галофильных M и 93% для негалофильных M).Примечательно, что этот аминокислотный состав отличается от описанного для Halobacteria , где увеличение содержания небольших гидрофобных остатков было указано как ключевой компонент механизма адаптации (Paul et al., 2008; Nath, 2016). С другой стороны, внешняя оболочка белков Halobacteria характеризуется хорошо известным увеличением кислотных остатков (Asp и Glu, 109 и 46% соответственно) вместе со значительным снижением Lys (около 72%) и общее снижение нейтральных полярных остатков, таких как Ser, Gln и Asn (42, 63 и 66%, соответственно) (рис. 2C).Еще раз, когда сравнивали внешнюю оболочку негалофильного и галофильного белков Methanosarcinales , был обнаружен почти идентичный аминокислотный состав (рис. 2D). Однако наблюдалось заметное увеличение содержания Asp с галофильными белками, представляющими 72% различия по сравнению с Eukarya , тогда как в негалофильных белках это было только 39%.

РИСУНОК 2. Аминокислотный состав внутренней и внешней оболочки АДФ-зависимых киназ из Halobacteria и Methanosarcinales. точек на графиках представляют средний процент каждого остатка, находящегося в соответствующей оболочке моделей гомологии. Все результаты сравниваются с АДФ-зависимыми киназами из Eukarya в качестве контроля. (A) Внутренняя оболочка белков из Halobacteria . (B) Внутренняя оболочка белков из Methanosarcinales (Ms). (C) Белки внешней оболочки из Halobacteria . (D) Внешняя оболочка белков из Methanosarcinales (Ms).

Наиболее разительным отличием по сравнению с внешней оболочкой, наблюдаемым у белков из Halobacteria , является большое увеличение Lys (примерно в два раза по сравнению с Eukarya и в семь раз по сравнению с Halobacteria ). Это стоит отметить, поскольку некоторые авторы предположили, что содержание Lys по сравнению с Asp / Glu является основной основой галофильного характера белков из Halobacteria из-за уменьшения гидрофобной области, подверженной воздействию растворителя (Paul et al., 2008; Тадео и др., 2009).

Для дальнейшего анализа распределения остатков, наблюдаемого в моделях, мы оценили две основные структурные особенности, связанные со стабильностью соли, которые напрямую коррелируют с аминокислотным составом белка; электростатический поверхностный заряд и гидрофобные взаимодействия в ядре. На рисунке 3А показана полярная и заряженная доступная площадь поверхности (ASA) для белков из каждой группы. Белки из Halobacteria демонстрируют заметное увеличение заряженного АСК по сравнению с полярным АСК, в то время как белки из галофильных и негалофильных организмов Methanosarcinales также обладают этим признаком, но менее выраженным.С другой стороны, эукариотические белки показывают почти равное количество заряженной и полярной ASA. Эти характеристики подчеркнуты на рисунке 3B, который показывает типичную поверхность электростатического потенциала для каждой группы. АДФ-ПФК из Halobacteria имеют преимущественно отрицательно заряженную поверхность, которая значительно уменьшена у Eukarya . С другой стороны, обе группы Methanosarcinales показывают сильный положительный компонент на своей поверхности, вероятно, из-за высокого содержания Lys.На рис. 3С представлена ​​графическая иллюстрация пространственного распределения остатков, составляющих ядро ​​белка. В белках из Halobacteria ядро ​​менее обширно по сравнению с ядром белков из эукариот или видов Methanosarcinales .

РИСУНОК 3. Галофильные черты моделей гомологии, построенных для ADP-PFK / GK из Halobacteria, Eukarya , галофильных и негалофильных Methanosarcinales . (A) Полярная и заряженная площадь поверхности, выраженная в процентах от ASA. (B) Поверхность электростатического потенциала репрезентативных моделей была сгенерирована, синяя для положительного и красная для отрицательного заряда (± 3 кОм _B T / e ). (C) Остатки ядра белка (внутренней оболочки) с использованием в качестве критерия экспонирования поверхностных остатков менее 5 Å. ² . Показана репрезентативная модель каждой группы; Natronorubrum bangense ( Halobacteria ), Homo sapiens ( Eukarya ), Methanohalobium evestigatum (галофильный Methanosarcinales ) и Methanosarcinales .

Наши результаты показывают, что белки галофильных организмов порядка Methanosarcinales не обладают ни структурными чертами, ни аминокислотным составом, классически наблюдаемым в Halobacteria , что поднимает вопрос о том, как эти белки способны проводить катализ в молярных концентрациях. соли. Поэтому мы приступили к экспериментальной оценке галофильного характера белков Methanosarcinales .

Влияние соли и глицинбетаина на активность существующих и наследственных ферментов

Methanosarcinales

Галофильный характер ферментов из Methanosarcinales был оценен путем выбора белков негалофильных и галофильных организмов (рисунок 1B и дополнительная таблица S1).PFK / GK из M. mazei (MmazPFK / GK) и M. evestigatum (MevePFK / GK) были выбраны в качестве репрезентативных примеров, соответственно. Чтобы дополнить сравнительное исследование и проследить эволюцию галофильного признака, мы вывели и экспериментально воскресили последнего распространенного предка PFK / GK-ADP порядка Methanosarcinales (AncMsPFK / GK) (дополнительный рисунок S2) (см. Раздел «Материалы»). и методы »).

Таблица 1 показывает, что три гетерогенно экспрессируемых фермента способны катализировать фосфорилирование обоих субстратов.Это согласуется с аннотациями, которые подразумевают, что они являются бифункциональными ферментами. С точки зрения активности ПФК-АДФ три фермента обладают сходными значениями k _cat и K _M . Однако в отношении их активности GK-ADP были обнаружены различия между предком и существующими ферментами, и как MevePFK / GK, так и MmazPFK / GK показали аналогичные значения K _M для глюкозы, тогда как для предка они были в 10 раз выше. Кроме того, для предкового фермента насыщение субстрата АДФ не было достигнуто даже при 30 мМ, что запрещает определение k _cat .

ТАБЛИЦА 1. Кинетические параметры Methanosarcinales ADP-зависимых киназ.

При насыщающей концентрации субстрата (рисунки 4A – C и дополнительный рисунок S3) мы обнаружили, что существующие ферменты Methanosarcinales ведут себя аналогичным образом в зависимости от концентрации соли, независимо от того, происходят ли они от негалофильных или галофильных организмов. Кроме того, активность обоих ферментов, по-видимому, снижается при повышенных концентрациях соли, и неожиданно негалофильная модель представила оптимальную потребность в соли выше, чем галофильная модель.Учитывая их способность сохранять значительную активность при высокой концентрации соли, их поведение можно рассматривать как галотолерантное, подобное тому, которое наблюдается для некоторых ферментов из Halobacteria (Pugh et al., 1970; Brown-peterson and Salin, 1993; Bonete et al. др., 1996). Кроме того, влияние NaCl на активность MevePFK / GK и MmazPFK / GK аналогично тому, которое наблюдается для KCl (дополнительный рисунок S3). Интересно, что предковый фермент не только активен при высоких концентрациях NaCl, но, по-видимому, фактически активируется им.Однако активность предкового фермента не может быть измерена в присутствии KCl, поскольку высокие концентрации этой соли вызывают осаждение в присутствии хлорной кислоты.

РИСУНОК 4. Влияние KCl, NaCl и глицинбетаина на активность ADP-PFK / GK из Methanosarcinales . Влияние KCl или NaCl на: (A) MevePFK / GK (галофильный), (B) MmazPFK / GK (негалофильный) и (C) ancMsPFK / GK (предок) активность в отсутствие и присутствие 1 М глицинбетаина. (D) Активность MevePFK / GK, MmazPFK / GK и ancMsPFK / GK в зависимости от концентрации глицинбетаина в отсутствие соли. Во всех случаях определения активности проводили при насыщающих концентрациях субстрата. Активность выражали в процентах от активности, полученной в отсутствие как соли, так и глицинбетаина.

Другим важным аспектом галофильной адаптации является присутствие глицинбетаина или других осмолитов в качестве защитных агентов против вредного воздействия гиперосмотической среды.Когда действие глицинбетаина (1,0 М) было проанализировано вместе с молярными концентрациями KCl, очевидно, что защитный эффект наблюдался для активности MevePFK / GK и MmazPFK / GK, в то время как явного влияния на активность AncMsPFK / GK обнаружено не было. Однако различные концентрации глицин-бетаина очень по-разному влияли на ферментативную активность в зависимости от исследуемого фермента. В то время как в случае галофильной модели наблюдался относительно небольшой эффект, 50% -ная активация наблюдалась в случае негалофильного фермента.Напротив, предковый фермент ингибировался глицин-бетаином, сохраняя только 50% своей активности при этой концентрации (рис. 4D).

Влияние соли и глицинбетаина на стабильность

Methanosarcinales белков

Учитывая, что Methanosarcinales ADP-зависимые киназы обладают лишь умеренной устойчивостью к ингибированию KCl и NaCl, и чтобы получить хорошее представление о галофильной адаптации этих белков, мы оценили влияние этих солей на стабильность белка (дополнительный рисунок S4).Используя круговой дихроизм, мы определили температуру плавления (Tm) как для существующих ферментов Methanosarcinales , так и для предка в присутствии различных концентраций KCl (рис. 5). Три фермента показали линейное увеличение их Tm с увеличением концентрации KCl, что согласуется с предыдущими исследованиями, которые показывают способность хосмотропных ионов повышать температуру плавления белков (Von Hippel and Schleich, 1969). Tm галофильного белка MevePFK / GK показывает наибольшее увеличение (около 12 ° C) в присутствии 2.0 М. соли. Примечательно, что при 0,5 М KCl Tm для предкового белка примерно на 30 ° C выше, чем для существующих ферментов, что подразумевает, что его следует классифицировать как гипертермофильный белок. Глицин бетаин вызывает смещение Tm MmazPFK / GK и MevePFK / GK до более высоких значений как при низких, так и при высоких концентрациях KCl. В случае MevePFK / GK и MmazPFK / GK наблюдался частично аддитивный эффект между глицинбетаином и KCl, что предполагает аналогичный механизм, лежащий в основе увеличения Tm, вызываемого этими двумя эффекторами (Roesser and Müller, 2001).

РИСУНОК 5. Температурная стабильность АДФ-зависимых киназных белков из Methanosarcinales. Температура плавления (Tm) как функция концентраций KCl и глицинбетаина. Красные столбцы указывают на различные концентрации KCl, тогда как синие столбцы показывают определения, сделанные также в присутствии глицинбетаина.

Белки MmazPFK / GK и MevePFK / GK были нестабильными при низких концентрациях KCl и постепенно стабилизируются при более высоких концентрациях.Интересно, что AncMsPFK / GK показал очень стабильный профиль при всех протестированных концентрациях KCl (от 0 до 2 M KCl) при инкубации при 60 ° C (рис. 6). Эта высокая стабильность согласуется с его гипертермофильным характером и может быть связана с повышенной стабильностью, демонстрируемой воскрешенными предковыми белками в целом (Trudeau et al., 2016).

РИСУНОК 6. Кинетическая стабильность существующих и предковых АДФ-зависимых киназ из Methanosarcinales . Остаточная активность PFK-ADP для ферментов Methanosarcinales. определяли с течением времени при различных концентрациях KCl; Кинетическую стабильность MevePFK (A) и MmazPFK (B) анализировали при 40 ° C, в то время как для ancMsPFK (C) использовали 60 ° C.В указанные моменты времени отбирали аликвоту, центрифугировали и анализировали ее активность при 30 ° C.

Определение структуры последнего общего предка PFK / GK из

Methanosarcinales

Учитывая отсутствие экспериментально определенных структур для АДФ-зависимых киназ из Methanosarcinales , были выполнены скрининга кристаллизации ферментов, охарактеризованных здесь. Мы получили только кристаллы для ancMsPFK / GK в комплексе с ADP, который был решен путем молекулярного замещения и уточнен до 2.Разрешение 86 Å. Сбор данных и статистика уточнения приведены в таблице 2. Структуру предкового фермента можно разделить на большие и малые альфа / бета домены, показывающие классическую укладку АДФ-зависимой киназы. Большой домен несет в себе архитектуру складки Россмана (α / β / α) с одиннадцатью β-листовыми цепями, окруженными четырнадцатью α-спиралями, а малый домен состоит из семи β-цепей и четырех α-спиралей, которые действуют как крышка. для активного сайта (рис. 7А). Молекула АДФ расположена в мелком кармане внутри большого домена, где сохраняются взаимодействия, наблюдаемые в других АДФ-зависимых киназах.(Рисунок 7B; Ито и др., 2001). Ион Mg ⁺² координирует α- и β-фосфаты АДФ вместе с четырьмя молекулами воды (дополнительный рисунок S5), показывая, что это первая структура АДФ-зависимой киназы, в которой металл активного центра только косвенно взаимодействует с белок через молекулы воды. Эти взаимодействия включают: боковые цепи Glu313 (мотив NXXE), Glu282 (мотив HXE) и Thr284 и карбонил основной цепи Phe283. Глутаминовые кислоты мотивов NXXE и HXE были ранее описаны как важные для связывания АДФ-Mg в семействе белков в целом и для образования тройных комплексов на уровне надсемейства рибокиназ (Abarca-Lagunas et al., 2015).

ТАБЛИЦА 2. Статистика сбора и уточнения данных для родительской структуры.

РИСУНОК 7. Кристаллографическая структура ancMsPFK / GK, сайтов связывания Mg-ADP и катионов. (A) Мультяшное изображение, окрашенное в соответствии с вторичной структурой; α-спирали окрашены в желтый цвет, β-тяжи — в синий, а петли — в зеленый. Молекула АДФ показана в виде палочек. Ионы Mg ²⁺ и Ni ²⁺ показаны красными и серыми сферами соответственно. (B) Сайт связывания АДФ, желтые пунктирные линии указывают полярные контакты, рассчитанные с помощью PyMOL. (C) Связывание Ni ²⁺ в минорном домене, координированном тремя остатками Asp (42, 44 и 45). (D) Связывание двух других ионов Ni ²⁺ в основном домене.

Другой особенностью этой структуры является связывание 3 катионов (Ni ²⁺ ), что может быть связано с высокой концентрацией металла, присутствующего в кристаллизационном растворе.Один из них расположен в начале α-спирали 2 и включает остатки Asp42, Asp44 и Asp45 (сайт I), происходящие из одной и той же цепи (рис. 7C). Два других узла образованы остатками, образующими контакты упаковки кристалла; сайт II состоит из His227 и Glu230 из двух симметрично связанных молекул, в то время как сайт III образован Asp298 из одной молекулы и Asp47 из симметрично связанной цепи (рис. 7D).

Сравнение структур ancMsPFK / GK и существующих PFK из Pyrococcus horikoshii (PhPFK, PDB 1U2X) из порядка Thermococcales показывает очень высокую структурную консервативность предкового фермента.Структурная суперпозиция обоих ферментов показала общее среднеквадратичное значение 2,2 Å между α-атомами углерода, хотя их последовательности идентичны только на 40%. Предковый фермент находится в немного более открытой конформации, чем PhPFK, что становится очевидным при сравнении расстояния между центрами масс малых и больших доменов, которое составляет 32 Å в PhPFK и 34 Å в ancMsPFK / GK. Анализ малого домена PhPFK и ancMsPFK / GK показал точно такие же элементы вторичной структуры с α-углеродным RMSD, равным 1.44 Å. Однако в большой области наблюдается внедрение некоторых дополнительных структурных элементов. Например, α-спираль 17 и β-цепь 17 отсутствуют в PhPFK, тогда как в предковом ферменте присутствует более крупная спираль 1 (на 20 остатков длиннее). Следовательно, RMSD α-углерода для больших доменов выше и составляет 1,77 Å. Примечательно, что области, соответствующие вставкам дополнительных элементов вторичной структуры, наблюдаемые в ancMsPFK / GK, также присутствуют в последовательностях всех ферментов Methanosarcinales , показывая, что это структурное различие, присутствующее в Methanosarcinales ADP-PFK / GKs по сравнению с ADP-PFK из Thermococcales (рис. 8A).

РИСУНОК 8. Галофильные черты строения предков. (A) Структура предка, окрашенная в соответствии с структурной консервативностью через семейство АДФ-зависимых киназ с использованием матрицы BLOSUM30, сохранение последовательности от высокого (синий) к низкому (красный). (B) Аминокислотный состав основных изменений, выявленных на рисунке 2 на внутренней и внешней оболочке, и процент площади полярной и заряженной экспонированной поверхности (ASA), рассчитанный с использованием веб-сервера VADAR.Соответствующее среднее содержание белков Eukarya (зеленый), галофильных Ms (голубой), негалофильных (оранжевый) и Halobacteria (красный) показано пунктирными линиями. (C) Поверхность электростатического потенциала предка, сгенерированная с помощью плагина APBS Tools для PyMOL, синяя для положительного и красного для отрицательного заряда (± 3 k _B T / e ). На рисунке показана конструкция, повернутая на 180 °. (D) Остатки ядра белка (внутренней оболочки) с использованием в качестве критерия экспонирования поверхностных остатков менее 5 Å. ² .

Анализ ключевых остатков, присутствующих во внешней оболочке структуры ancMsPFK / GK, показывает несколько специфических особенностей (рис. 8B). В соответствии с тем, что было обнаружено в белках Halobacteria , предок демонстрирует значительное увеличение содержания Glu, даже большее, чем наблюдаемое в Halobacteria , вместе с увеличением содержания Asp. Однако наиболее заметным является содержание лизина предка, которое даже больше, чем наблюдаемое в существующих белках из Methanosarcinales , и достигает почти девятикратного увеличения по сравнению с белками из Halobacteria .

Эти изменения влияют на полярный и заряженный ASA белка (рис. 8B), где размер заряженной поверхности аналогичен размерам, обнаруженным в белках из Halobacteria , в то время как размер его полярной поверхности остается ближе к размеру из Methanosarcinales. белков. Заметное увеличение содержания Lys приводит к заметному положительному заряду на поверхности молекулы, что легко увидеть по электростатическому потенциалу кристаллической структуры (рис. 8C).С другой стороны, внутренняя оболочка белка ancMsPFK / GK демонстрирует тенденцию, аналогичную тенденции, наблюдаемой в белках Methanosarcinales (фиг. 8B), показывая не преобладание остатков Ala, а скорее увеличение содержания Ile, что, в свою очередь, приводит к обширное гидрофобное ядро ​​(рис. 8D). Эти результаты показывают, что ancMsPFK / GK достигает своей высокой концентрационной стабильности в основном за счет сильно заряженной поверхности без восстановления его гидрофобного ядра.

Обсуждение

Галофильная адаптация белков стала предметом интенсивных исследований в последние годы.Тем не менее, всеобъемлющая модель, которая объединяет то, как эти молекулы остаются растворимыми и сталкиваются с различными средами, в которых обитают галофильные организмы, все еще отсутствует. В течение последних 50 лет исследования были сосредоточены на белках порядка Halobacteria , которые являются классической моделью для изучения этих молекулярных адаптаций (Lanyi, 1974). Однако в настоящее время признано, что многие галофильные организмы принадлежат к порядку Methanosarcinales , который демонстрирует большое разнообразие от негалофильных видов до экстремальных галофилов.Однако галофильные адаптации, встречающиеся в белках этих организмов, еще предстоит решить.

Три основных различия в распределении аминокислот галофильных ( Halobacteria ) и негалофильных белков широко известны. Один из них — это избыток кислотных остатков на поверхности белка, другой — значительное уменьшение открытой гидрофобной области (в основном вызванное уменьшением остатков лизина, экспонируемых на поверхности), а третье — уменьшение объема гидрофобного ядра. .При сравнении аминокислотного состава внутренней и внешней оболочки АДФ-зависимых ферментов из галофильных и негалофильных видов Methanosarcinales не было обнаружено значительных различий, хотя они оба отличаются от классических сигнатур, присутствующих в галофильных белках из Halobacteria . или негалофильные белки из Eukarya . В частности, наблюдалось увеличение содержания изолейцина во внутренней оболочке. Эта тенденция противоположна описанной для Halobacteria , где сообщалось об уменьшении больших гидрофобных остатков (Leu, Phe, Ile) (Lanyi, 1974; Paul et al., 2008; Siglioccolo et al., 2011). Вероятно, ограниченная конформационная свобода и размер боковой цепи изолейцина приводят к меньшей потере конформационной энтропии при сворачивании белка, одновременно сохраняя большую площадь гидрофобного контакта, что приводит к общему увеличению стабильности. Другой известный механизм включает увеличение содержания аланина, что дает большее энтропийное преимущество, но приводит к уменьшению размера гидрофобного ядра. Этому также способствовала бы среда с высокой ионной силой, которая усиливает гидрофобный эффект.Однако уменьшение размера гидрофобного ядра явно не является адаптивным механизмом, возникшим у Methanosarcinales.

С другой стороны, внешняя оболочка обеих групп Methanosarcinales разделяла с белками Halobacteria увеличение Asp и Glu и снижение Ser. Однако наиболее разительным отличием является содержание Lys во внешней оболочке. В белках из Halobacteria этот остаток практически не уменьшается, тогда как в белках Methanosarcinales он увеличивается в два раза по сравнению с Eukarya .Это конкретное аминокислотное распределение белков Methanosarcinales поддерживает идею новых и неканонических молекулярных адаптаций, чтобы противостоять жизни в галофильной среде. Более того, эта стратегия присутствует в белков Methanosarcinales , начиная от негалофильных организмов и заканчивая экстремальными галофилами. Очевидно, что они разработали совершенно другую стратегию с точки зрения их гидрофобного ядра и, тем не менее, частично аналогичную с точки зрения их молекулярной поверхности, по крайней мере, в той степени, в которой они имеют сильно заряженные поверхности по сравнению с Eukarya .Чистое увеличение заряженных остатков (Lys, Asp, Glu) во внешней оболочке белков Methanosarcinales может быть связано с тем фактом, что эти остатки считаются лучшими кандидатами для увеличения растворимости белка при высоких концентрациях соли (Trevino и др., 2007). Что касается механизма адаптации, представленного в Halobacteria , содержание Lys было выделено как основной ответственный остаток, поскольку двукратное снижение его содержания приводит к четырехкратному уменьшению площади, подверженной воздействию гидрофобного растворителя, вносимой этим остатком (Britton et al., 2006). Этот факт напрямую связан с дестабилизацией, проявляемой Halobacteria при низких концентрациях KCl (Tadeo et al., 2009). Взятые вместе, наши результаты подтверждают механизм адаптации к галофильной среде, который отличается от текущих моделей, предложенных для белков из Halobacteria (Madern et al., 2000; Qvist et al., 2012).

Для дальнейшего изучения вклада этих остатков в галофильный характер белков Methanosarcinales следует провести всесторонний мутационный анализ.Однако такого рода исследования очень сложны, поскольку, как продемонстрировала новаторская работа по мутациям белков из Halobacteria , один и тот же остаток, расположенный в разных положениях на поверхности белка, может по-разному влиять на галофильный характер. Это может быть связано с его потенциальными эпистатическими взаимодействиями, его вкладом в формирование вторичной структуры или стабильности белка, среди других факторов (Jolley et al., 1997; Esclapez et al., 2007; Tadeo et al., 2009).

Другой примечательной особенностью галофильных белков является наличие соли как предпосылки для активности (Mevarech et al., 2000). Во многих случаях при удалении соли обнаруживается потеря ферментативной активности, и это можно коррелировать со структурными данными. Тем не менее, сообщается о некоторых исключениях, когда ферменты оставались полностью активными и структурированными даже в отсутствие соли (Madern and Zaccai, 2004; Hutcheon et al., 2005). Эти результаты отличаются от результатов, наблюдаемых для ферментов негалофильных организмов, которые лишь незначительно активны при концентрациях NaCl / KCl выше 0,5 М и полностью неактивны при молярных концентрациях солей (Wright et al., 2002). Таким образом, что касается солевой зависимости изученных здесь ферментов от Methanosarcinales видов, их можно отнести к умеренно галофильным белкам из-за существенного сохранения активности ферментов при молярных концентрациях солей.

С другой стороны, организмы Methanosarcinales представляют более сложную стратегию в отношении осмотического противовеса, поскольку они накапливают не только внутриклеточные неорганические ионы до концентраций выше 1 М, но также осмолиты, такие как глицин бетаин (Lai and Gunsalus, 1992).Этот осмолит способен защищать активность фермента от ингибирования NaCl / KCl, а также повышать термостабильность белков (Bowlus and Somero, 1979; Pollard and Wyn Jones, 1979). Наши анализы показали, что присутствие 1 М глицинбетаина наряду с высокими концентрациями соли имеет различный эффект в зависимости от исследуемого фермента; он защищает ферментативную активность галофильных и негалофильных модельных ферментов, но не оказывает значительного влияния на предков. Хотя для подтверждения этой тенденции необходимы дальнейшие эксперименты, результаты предполагают, что глицин-бетаиновая защита активности фермента в галофильной модели могла быть возникающим признаком, который отсутствовал у последнего общего предка PFK / GK-ADP.Более того, подобное поведение, наблюдаемое для ферментов Methanosarcinales с точки зрения активности и стабильности в присутствии соли, может быть объяснено их сходным аминокислотным составом, тогда как защитное действие глицин-бетаина на ферментативную активность галофильной модели может быть связано с на его взаимодействие со специфическими аминокислотными остатками, связанными с активным центром.

Галофильный характер также отражен в данных кругового дихроизма, которые показывают линейное увеличение стабильности (температуры плавления) в зависимости от концентрации KCl.Хотя увеличение Tm неорганическими ионами является общей характеристикой белков (Von Hippel and Schleich, 1969), эта особенность более выражена в галофильных белках, скорее всего, из-за дестабилизации развернутого состояния (Ortega et al., 2015). Здесь эта особенность была воспроизведена как для существующих, так и для предковых ферментов, как показано в данных термической и кинетической стабильности. В соответствии с предыдущими сообщениями, описывающими влияние глицинбетаина на Tm, мы обнаружили, что этот осмолит увеличивает температуру плавления белков Methanosarcinales (Bowlus and Somero, 1979).Однако, когда глицин бетаин анализируется в присутствии KCl, наблюдался неаддитивный эффект, предполагающий, что аналогичный механизм может лежать в основе действия обоих соединений. Опосредованное осмолитом увеличение Tm объясняется балансом двух эффектов; с одной стороны, способность осмолитов предпочтительно гидратировать белки, приводя к стабилизации белков, а с другой — дестабилизирующий эффект из-за умеренно благоприятного взаимодействия открытых гидрофобных боковых цепей с неполярными частями осмолита (Santoro et al., 1992; Auton et al., 2011). Стратегии адаптации, принятые белками Methanosarcinales , могут быть результатом совместной эволюции осмолитов, которая снизила адаптивное давление, действующее на их белки.

Неожиданно оказалось, что АДФ-ПФК / ГК из негалофильных и галофильных организмов обладали несколькими галофильными характеристиками, описанными выше. Это привело нас к рассмотрению галофильного характера последнего общего предка этих организмов. Предковый фермент был так же устойчив к соли, как и галофильные белки из Halobacteria .Хотя структурно предковый белок не обнаруживает существенных различий с существующими АДФ-зависимыми киназами с точки зрения его аминокислотного состава, он имеет несколько поразительных особенностей. Среди них выделяются содержание Lys на его поверхности и отсутствие уменьшения размера гидрофобного ядра. Эти особенности являются общими для тех, которые мы наблюдаем у существующих ферментов, и, по-видимому, они вносят наибольший вклад в неканоническую стратегию галофильной адаптации в этом семействе белков.Вероятно, галофильные черты, присутствующие в предковом ферменте, были сохранены во время эволюции даже у негалофильных организмов, поскольку они представляют собой недостаточный недостаток, чтобы быть быстро устраненными естественным отбором и оставались следствием эволюции.

Поразительно, но предковый фермент также демонстрирует чрезвычайно высокую температуру плавления (примерно 90 ° C), что согласуется с предыдущими сообщениями, показывающими высокую стабильность воскрешенных предковых белков. Кроме того, предковый фермент демонстрирует высокую кинетическую стабильность и повышенную активность при молярных концентрациях соли.Мы утверждаем, что реконструкция предковых ферментов открывает новые направления исследований для изучения галофильного характера предковых ферментов как потенциального инструмента в биотехнологии и раскрытия молекулярной эволюции галофильных организмов и их белков.

Авторские взносы

VC-F, FG-O и VG разработали проект и разработали исследовательский компьютер, построив модели структуры белка и выполнив биоинформатический анализ. ФГ-О, РЗ и ПК провели филогенетический анализ.FG-O, NF-U и SM провели эксперимент по кинетике и стабильности ферментов. FG-O, NF-U, SM, DL, RG и VC-F выполнили и проанализировали эксперимент по кристаллографии белка. Документ написали FG-O, PC, RG, VC-F и VG.

Финансирование

Эта работа была поддержана Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt Grant 1150460 для VG и 3160332 для VC-F). Стипендия Vicerrectoría de Investigación y Desarrollo (VID-Universidad de Chile) FG-O поддержала стипендию для проведения исследовательской работы в клинике Dr.Лаборатория Ричарда Гарратта, поддерживаемая FAPESP, включая обучение в DL. Оборудование для кругового дихроизма финансировалось Fondequip EQM 140151. Высокопроизводительный робот-кристаллизатор ARI финансировался Fondequip EQM 120208.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарны Матиасу Фуэнтеалба и докторуРикардо Кабрера (Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile) за доступ и техническую поддержку в использовании высокопроизводительного робота-кристаллизатора, а также доктору Ане ПУ Араужу и доктору Умберто М. Перейре (Instituto de Física de São Carlos, Universidade de São Paulo, Brazil) за техническую поддержку CD и анализов кристаллизации соответственно. Мы также благодарим разработчиков и преподавателей кристаллографической школы CCP4 / APS (2017), доктора Фелипе Транджтенберга и доктора Алехандро Бускьяццо (Institut Pasteur de Montevideo), участвовавших в процессе успешного определения, уточнения и проверки кристаллической структуры.В этом исследовании использовались ресурсы Бразильской лаборатории синхротронного света (LNLS), открытого национального центра, управляемого Бразильским центром исследований в области энергетики и материалов (CNPEM) Министерства науки, технологий, инноваций и коммуникаций Бразилии (MCTIC). Благодарим сотрудников компании MX2 за помощь во время дифракционных экспериментов.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https: // www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2018.01305/full#supplementary-material

Список литературы

Абарка-Лагунас, М. Дж., Ривас-Пардо, Дж. А., Рамирес-Сармьенто, К. А. и Гиксе, В. (2015). Анализ функциональных ролей консервативных мотивов NXXE и HXE АДФ-зависимой глюкокиназы из Thermococcus litoralis . FEBS Lett. 589, 3271–3276. DOI: 10.1016 / j.febslet.2015.09.013

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Адамс, П.Д., Афонин, П. В., Бункоци, Г., Чен, В. Б., Дэвис, И. В., Эчолс, Н. и др. (2010). PHENIX: комплексная система на основе Python для решения макромолекулярных структур. Acta Crystallogr. 66, 213–221. DOI: 10.1107 / S049025

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Auton, M., Rösgen, J., Sinev, M., Marcelo, L., Holthauzen, F., and Bolen, D. W. (2011). Осмолит влияет на стабильность и растворимость белка: балансирует между основной цепью и боковыми цепями. Biophys. Chem. 159, 90–99. DOI: 10.1016 / j.bpc.2011.05.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бонете, М. Дж., Пире, К., Ллорка, Ф. И., и Камачо, М. Л. (1996). Глюкозодегидрогеназа из галофильных архей Haloferax mediterranei : очистка фермента, характеристика и N-концевая последовательность. FEBS Lett. 383, 227–229. DOI: 10.1016 / 0014-5793 (96) 00235-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Bowlus, R.Д. и Сомеро Г. Н. (1979). Совместимость растворенных веществ с функцией и структурой ферментов: обоснование выбора осмотических агентов и конечных продуктов анаэробного метаболизма у морских беспозвоночных. J. Exp. Zool. 208, 137–151. DOI: 10.1002 / jez.1402080202

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бриттон, К. Л., Бейкер, П. Дж., Фишер, М., Ружейников, С., Гилмор, Д. Дж., Бонете, М.-Дж., и др. (2006). Анализ взаимодействия белков-растворителей в глюкозодегидрогеназе из крайнего галофила Haloferax mediterranei . Proc. Natl. Акад. Sci. США 103, 4846–4851. DOI: 10.1073 / pnas.0508854103

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Браун-Петерсон, Н. Дж., И Салин, М. Л. (1993). Очистка каталазы-пероксидазы из Halobacterium halobium : характеристика некоторых уникальных свойств галофильного фермента. J. Bacteriol. 175, 4197–4202. DOI: 10.1128 / jb.175.13.4197-4202.1993

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бургграф, С., Чинг, А., Стеттер, К. О., и Вёзе, К. Р. (1991). Последовательность Methanospirillum hungatei 23S рРНК подтверждает специфическую связь между крайними галофилами и Methanomicrobiales. Syst. Прил. Microbiol. 14, 358–363. DOI: 10.1016 / S0723-2020 (11) 80310-3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кастро-Фернандес, В., Эррера-Моранде, А., Замора, Р., Мерино, Ф., Гонсалес-Орденес, Ф., Падилья-Салинас, Ф. и др. (2017).Реконструированные предковые ферменты показывают, что отрицательный отбор управлял эволюцией субстратной специфичности АДФ-зависимых киназ. J. Biol. Chem. 292, 15598–15610. DOI: 10.1074 / jbc.M117.7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кристиан, Дж. Х. Б. и Уолто, Дж. (1962). Концентрации растворенных веществ в клетках галофильных и негалофильных бактерий. Биохим. Биофиз. Acta 65, 506–508. DOI: 10.1016 / 0006-3002 (62)-5

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Айзенберг, Д., Лути Р. и Боуи Дж. (1997). VERIFY3D: оценка моделей белков с трехмерными профилями. Methods Enzymol. 277, 396–404. DOI: 10.1016 / S0076-6879 (97) 77022-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эсклапес, Дж., Пире, К., Баутиста, В., Мартинес-Эспиноза, Р. М., Феррер, Дж., И Бонете, М. Дж. (2007). Анализ кислой поверхности глюкозодегидрогеназы Haloferax mediterranei методом сайт-направленного мутагенеза. FEBS Lett. 581, 837–842. DOI: 10.1016 / j.febslet.2007.01.054

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эсвар, Н., Эрамиан, Д., Уэбб, Б., Шен, М.-Й., и Сали, А. (2008). «Моделирование структуры белка с помощью MODELLER», в Structural Proteomics , ред. Б. Кобе, М. Гусс и Т. Хубер (Нью-Йорк, Нью-Йорк: Humana Press), 145–159. DOI: 10.1007 / 978-1-60327-058-8_8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фукути, С., Ёсимунэ, К., Вакаяма, М., Моригути, М., и Нисикава, К. (2003). Уникальный аминокислотный состав белков галофильных бактерий. J. Mol. Биол. 327, 347–357. DOI: 10.1016 / S0022-2836 (03) 00150-5

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hutcheon, G. W., Vasisht, N., and Bolhuis, A. (2005). Характеристика высокостабильной α-амилазы из галофильной археи Haloarcula hispanica . Экстремофилы 9, 487–495. DOI: 10.1007 / s00792-005-0471-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ито, С., Фусинобу, С., Йошиока, И., Кога, С., Мацудзава, Х., и Вакаги, Т. (2001). Структурная основа АДФ-специфичности новой глюкокиназы из гипертермофильных архей. Строение 9, 205–214. DOI: 10.1016 / S0969-2126 (01) 00577-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джолли, К. А., Рассел, Р. Дж. М., Хью, Д. У. и Дэнсон, М. Дж. (1997). Сайт-направленный мутагенез и галофильность дигидролипоамиддегидрогеназы из галофильных архей, Haloferax volcanii . евро. J. Biochem. 248, 362–368. DOI: 10.1111 / j.1432-1033.1997.00362.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Kengen, S. W., De Bok, F. A., Van Loo, N. D., Dijkema, C., Stams, A. J., and De Vos, W. M. (1994). Доказательства действия нового пути Эмбдена-Мейерхофа, который включает АДФ-зависимые киназы во время ферментации сахара Pyrococcus furiosus . J. Biol. Chem. 269, 17537–17541.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Лай, М.К. и Гансалус Р. П. (1992). Глицин бетаин и ион калия являются основными совместимыми растворенными веществами в чрезвычайно галофильном метаногене, штамме Z7302 Methanohalophilus. J. Bacteriol. 174, 7474–7477. DOI: 10.1128 / jb.174.22.7474-7477.1992

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лай, М. К., Сауэрс, К. Р., Робертсон, Д. Э., Робертс, М. Ф., и Гансалус, Р. П. (1991). Распределение совместимых растворенных веществ в галофильных метаногенных архебактериях. J. Bacteriol. 173, 5352–5358. DOI: 10.1128 / jb.173.17.5352-5358.1991

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ланьи, Дж. К. (1974). Солевозависимые свойства белков чрезвычайно галофильных бактерий. Бактериол. Ред. 38, 272–290.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Ларсен, Х. (1967). Биохимические аспекты крайней галофильности. Adv. Microb. Physiol. 1, 97–132. DOI: 10.1016 / S0065-2911 (08) 60251-9

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ласковски, Р.А., Макартур, М. В., Мосс, Д. С., и Торнтон, Дж. М. (1993). PROCHECK: программа для проверки стереохимического качества белковых структур. J. Appl. Кристаллогр. 26, 283–291. DOI: 10.1107 / S00218898

944

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лю Ю. (2010). « Methanosarcinales » в Справочнике по углеводородной и липидной микробиологии , изд. К. Н. Тиммис (Гейдельберг: Springer).

Google Scholar

Мадерн, Д., Эбель, К., и Заккаи, Г. (2000). Галофильная адаптация ферментов. Экстремофилы 4, 91–98. DOI: 10.1007 / s007

0142

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мадерн Д. и Заккаи Г. (2004). Молекулярная адаптация: малатдегидрогеназа из крайне галофильной бактерии Salinibacter ruber ведет себя как негалофильный белок. Biochimie 86, 295–303. DOI: 10.1016 / j.biochi.2004.04.004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нарасингарао, П., Podell, S., Ugalde, J. A., Brochier-Armanet, C., Emerson, J. B., Brocks, J. J., et al. (2012). Метагеномная сборка de novo выявляет многочисленные новые основные линии архей в гиперсоленых микробных сообществах. ISME J. 6, 81–93. DOI: 10.1038 / ismej.2011.78

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ортега, Г., Диркс, Т., и Миллет, О. (2015). Адаптация галофильных белков является результатом синергических взаимодействий остатков и ионов в свернутом и развернутом состояниях. Chem. Биол. 22, 1597–1607. DOI: 10.1016 / j.chembiol.2015.10.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пол С., Бэг С. К., Дас С., Харвилл Э. Т. и Датта К. (2008). Молекулярная подпись гиперсоленой адаптации: выводы из генома и протеомного состава галофильных прокариот. Genome Biol. 9: R70. DOI: 10.1186 / GB-2008-9-4-r70

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Филлипс, Дж.К., Браун, Р., Ван, В., Гумбарт, Дж., Тайхоршид, Э., Вилья, Э. и др. (2005). Масштабируемая молекулярная динамика с NAMD. J. Comput. Chem. 26, 1781–1802. DOI: 10.1002 / jcc.20289

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пью, Э. Л., Васеф, М. К., и Кейтс, М. (1970). Ингибирование синтетазы жирных кислот в Halobacterium cutirubrum и Escherichia coli за счет высоких концентраций соли. Банка. J. Biochem. 49, 953–958.DOI: 10.1139 / o71-138

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Qvist, J., Ortega, G., Tadeo, X., Millet, O., and Halle, B. (2012). Динамика гидратации галофильного белка в свернутом и развернутом состояниях. J. Phys. Chem. В 116, 3436–3444. DOI: 10.1021 / JP3000569

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рихтер, Дж. П., Горонси, А. К., Ронимус, Р. С., Сазерленд-Смит, А. Дж. (2016). Структурная и функциональная характеристика АДФ-зависимой глюкокиназы млекопитающих. J. Biol. Chem. 291, 3694–3704. DOI: 10.1074 / jbc.M115.679902

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Русер М. и Мюллер В. (2001). Осмоадаптация у бактерий и архей: общие принципы и различия. Environ. Microbiol. 3, 743–754. DOI: 10.1046 / j.1462-2920.2001.00252.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Санторо, М. М., Лю, Ю., Хан, С. М., Хоу, Л. X., и Болен, Д.W. (1992). Повышенная термостабильность белков в присутствии осмолитов природного происхождения. Биохимия 31, 5278–5283. DOI: 10.1021 / bi00138a006

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сиглиокколо А., Пайардини А., Пискителли М. и Паскарелла С. (2011). Структурная адаптация экстремально галофильных белков за счет уменьшения консервативной гидрофобной контактной поверхности. BMC Struct. Биол. 11:50. DOI: 10.1186 / 1472-6807-11-50

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тадео, X., Лопес-Мендес, Б., Тригуэрос, Т., Лаин, А., Кастаньо, Д., и Милле, О. (2009). Структурные основы аминокислотного состава белков галофильных архей. PLoS Biol. 7: e1000257. DOI: 10.1371 / journal.pbio.1000257

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тревино, С. Р., Шольц, Дж. М., и Пейс, К. Н. (2007). Вклад аминокислот в растворимость белка: Asp, Glu и Ser вносят более благоприятный вклад, чем другие гидрофильные аминокислоты в РНКазе Sa. J. Mol. Биол. 366, 449–460. DOI: 10.1016 / j.jmb.2006.10.026

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Трюдо Д. Л., Кальтенбах М. и Тауфик Д. С. (2016). О потенциальных источниках высокой стабильности реконструированных предковых белков. Мол. Биол. Evol. 33, 2633–2641. DOI: 10.1093 / molbev / msw138

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фон Хиппель, П. Х., и Шлейх, Т. (1969).Влияние ионов на структуру раствора биологических макромолекул. В соотв. Chem. Res. 2, 257–265. DOI: 10.1021 / ar50021a001

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вринд, Г. (1990). ЧТО ЕСЛИ: программа молекулярного моделирования и дизайна лекарств. J. Mol. График. 8, 52–56, 29. doi: 10.1016 / 0263-7855 (90) 80070-V

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Weinisch, L., Kühner, S., Roth, R., Grimm, M., Roth, T., Netz, D. J. A., et al. (2018).Идентификация осмоадаптивных стратегий у галофильных гетеротрофных инфузорий Schmidingerothrix salinarum . PLoS Biol. 16: e2003892. DOI: 10.1371 / journal.pbio.2003892

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Видерштейн, М., и Сиппл, М. Дж. (2007). ProSA-web: интерактивный веб-сервис для распознавания ошибок в трехмерных структурах белков. Nucleic Acids Res. 35, W407 – W410. DOI: 10.1093 / нар / гкм290

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Уиллард, Л., Ранджан, А., Чжан, Х., Монзави, Х., Бойко, Р. Ф., Сайкс, Б. Д. и др. (2003). VADAR: веб-сервер для количественной оценки качества структуры белков. Nucleic Acids Res. 31, 3316–3319. DOI: 10.1093 / nar / gkg565

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Райт, Д. Б., Бэнкс, Д. Д., Ломан, Дж. Р., Хильзенбек, Дж. Л., и Глосс, Л. М. (2002). Влияние солей на активность и стабильность дигидрофолатредуктаз Escherichia coli и Haloferax volcanii . J. Mol. Биол. 323, 327–344. DOI: 10.1016 / S0022-2836 (02) 00916-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Юсеф, Н. Х., Сэвидж-Эшлок, К. Н., Маккалли, А. Л., Людтке, Б., Шоу, Э. И., Хофф, В. Д. и др. (2014). Биосинтез трегалозы / 2-сульфотрегалозы и захват глицин-бетаина являются широко распространенными механизмами осмоадаптации в Halobacteriales. ISME J. 8, 636–649. DOI: 10.1038 / ismej.2013.165

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Замора, Р.А., Гонсалес-Орденес, Ф., Кастро-Фернандес, В., и Гиксе, В. (2017). АДФ-зависимые фосфофруктокиназы из архей порядка Methanosarcinales проявляют избыточную глюкокиназную активность. Arch. Biochem. Биофиз. 633, 85–92. DOI: 10.1016 / j.abb.2017.09.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Практическое руководство для нефизиков

1. Лаутербур ПК. Формирование изображения с помощью индуцированных локальных взаимодействий: примеры с использованием ядерного магнитного резонанса.Природа 1973; 242: 190–191. [PubMed] [Google Scholar] 2. Мэнсфилд П. и Grannell PK. «Дифракция» ЯМР в твердых телах. J Phys C 1973; 6: L422 – L426. [Google Scholar] 3. Кломп DWJ, ван дер Грааф М, Виллемсен МААП, ван дер Меулен APM, Heerschap A. Передающая / принимающая катушка для оптимальной 1H МР-спектроскопии головного мозга у педиатрических пациентов при 3T. МАГМА 2004; 17: 1–4. [PubMed] [Google Scholar] 4. Улица AM. Конструкция переключателя RF. Учебный курс IEEE 2000: Как проектировать ВЧ схемы 2000; 27: 1–7. [Google Scholar]

5.Токумицу Т, Тойода I, Айкава М. Низковольтный, высокомощный МИС переключателя T / R с LC-резонаторами. На симпозиуме IEEE по монолитным схемам микроволнового и миллиметрового диапазона, Атланта, Джорджия, 1993.

6. Сандрамурти С.В., Эпель Б, Почтовик C, Halpern HJ. Переключатель передачи / приема на основе пассивного двойного циркулятора для использования с отражающими резонаторами в импульсном электронном парамагнитном резонансе. Концепции Магнитного Резона Часть B 2009; 35B: 133–138. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 7. МакРобби Д.В., Мур EA, Могилы MJ, Принц MR.МРТ — От картинки к протону, 2-е изд. Нью-Йорк: Издательство Кембриджского университета, 2006. [Google Scholar]

8. Райт С.М. Массивы петель приемника. Энциклопедия магнитного резонанса 2011: 1–13.

9. Барри Смит N, Уэбб А. Введение в медицинскую визуализацию — физика, инженерия и клинические приложения. Кембридж, Великобритания: Издательство Кембриджского университета, 2010. [Google Scholar] 10. Mispelter J, Лупу М, Бриге А. Зондовые головки ЯМР для биофизических и миомедицинских экспериментов: теоретические принципы и практические рекомендации.Лондон: Imperial College Press, 2006. [Google Scholar] 11. Чен CN, Холт Д.И., Затонул VJ. Квадратурные катушки обнаружения — еще одно улучшение чувствительности на √2. Дж Магн Резон 1983; 54: 324–327. [Google Scholar] 12. Гловер Г.Х., Хейс CE, Pelc NJ, et al. Сравнение линейной и круговой поляризации для магнитно-резонансной томографии. Дж Магн Резон 1985; 54: 255–270. [Google Scholar] 13. Холт Д.И. Приемник ЯМР: описание и анализ конструкции. Прогр ЯМР Спектроскоп 1978: 41–77. [Google Scholar]

14.Кауфман Л, Аракава М, МакАртен Б.М., Фен Дж. Х., Краснор С. Переключаемая решетка радиочастотных катушек МРТ с отдельными катушками, имеющими разные и перекрывающиеся поля зрения. Патент США 4.881.034, 14 ноября 1989 г.

15. Акерман Дж. Дж., Роща ТД, Вонг Г.Г., Гадиан Д.Г., Радда Г.К. Картирование метаболитов у целых животных методом ЯМР 31P с использованием поверхностных катушек. Природа 1980; 283: 167–170. [PubMed] [Google Scholar] 16. Олигер М.А., Sodickson DK. Введение в конструкцию катушечной матрицы для параллельной МРТ. ЯМР Биомед 2006; 19: 300–315. [PubMed] [Google Scholar]

17.Boskamp EB, Линдси С.А., Lorbiecki JE. О вкладе шума катушки в отношение сигнал / шум в зависимости от диаметра катушки, температуры, частоты и расстояния до нагрузки. В: Proc 13-е ежегодное собрание ISMRM, Майами; 2005 г.

18. Requardt H, Офферманн Дж., Кесс Х, Краузе Н, Вебер Х. Поверхностная катушка с изменяемой геометрией: новый инструмент для МРТ позвоночника. Радиология 1987. 165: 572–573. [PubMed] [Google Scholar]

19. Boskamp EB. Новая революция в технологии поверхностных катушек: массивные поверхностные катушки. В: Proc. 6-е ежегодное научное собрание и конференция ISMRM, Нью-Йорк; 1987 г.

20. Райт С.М., Магин Р.Л., Kelton JR. Массивы взаимно связанных приемных катушек: теория и применение. Магн Резон Мед 1991; 17: 252–268. [PubMed] [Google Scholar] 21. Ремер ПБ, Эдельштейн WA, Хейс CE, Соуза СП, Мюллер ОМ. Фазированная решетка ЯМР. Магн Резон Мед 1990; 16: 192–225. [PubMed] [Google Scholar] 22. Фенн Эй Джей, Temme DH, Делани В.П., Кортни У. Развитие технологии радаров с фазированной антенной решеткой. Линкольн Лаборатория J 2000; 12: 321–340. [Google Scholar] 23. Balanis CA. Теория антенн: Анализ и проектирование, 4-е изд.Хобокен, Нью-Джерси: Wiley-Interscience, 2015. [Google Scholar] 24. Хейс CE, Hattes N, Ремер ПБ. Объемная визуализация с помощью МРТ-фазированных решеток. Магн Резон Мед 1991; 18: 309–319. [PubMed] [Google Scholar] 25. Raaijmakers AJE, Люйтен PR, ван ден Берг CAT. Дипольные антенны для визуализации тела в сверхсильных полях: сравнение с петлевыми катушками. ЯМР Биомед 2016; 29: 1122–1130. [PubMed] [Google Scholar]

26. Виггинс Г.К. Смесительные петли и электрические дипольные антенны для повышенной чувствительности при 7 теслах. В: Протокол 21-го ежегодного собрания ISMRM, Солт-Лейк-Сити; 2013.

27. Хейс CE, Эдельштейн WA, Шенк Дж. Ф., Мюллер О.М., Иш М. Эффективная высокодомогенная радиочастотная катушка для ЯМР-визуализации всего тела при 1,5 Тл. Дж Магн Резон 1985. 63: 622–628. [Google Scholar] 28. Авдиевич Н.И. Поперечные электромагнитные катушки для конечностей. eMagRes 2011 г. [Google Scholar] 29. Серебряный МС, Джозеф Р.И., Холт Д.И. Селективная инверсия спина в ядерном магнитном резонансе и когерентной оптике посредством точного решения уравнения Блоха-Риккати. Phys Rev A 1985; 31: 2753–2755.[PubMed] [Google Scholar] 30. Бендалл MR, Гордон RE. Импульсы глубины и перефокусировки предназначены для многоимпульсного ЯМР с поверхностными катушками. Дж Магн Резон 1983; 53: 365–385. [Google Scholar]

31. Банда C, Cloos M, Виггинс Г.К. Чередующийся противоположный монопольный передающий-приемный массив для визуализации мозга 7T. В: Proc 22-е ежегодное собрание ISMRM, Милан; 2014 г.

32. Ли В, Cloos MA, Содиксон ДК, Wiggins GC, Параллельная конструкция массива приемопередатчиков с использованием модифицированного складчатого диполя для корпусов 7T.В: Протокол 21-го ежегодного собрания ISMRM, Солт-Лейк-Сити; 2013.

33. Лакшманан К, Cloos M, Латтанци Р, Sodickson DK. Круговой диполь. В: Proc 22-е ежегодное собрание ISMRM, Милан; 2014 г.

34. Еряман Ы, Гёрин Б, Косиор Р, Адальштейнссон Э, Wald LL. Комбинированные матрицы петля + диполь для визуализации мозга 7T. В: Протокол 21-го ежегодного собрания ISMRM, Солт-Лейк-Сити; 2013.

35. Латтанци Р, Виггинс Г.С., Чжан Б, Дуань Q, Коричневый R, Sodickson DK. Приближение к максимальному внутреннему соотношению сигнал / шум с рамочными и дипольными антеннами.Магн Резон Мед 2018; 79: 1789–1803. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 36. Raaijmakers AJE, ван ден Берг CAT. Антенны как элементы поверхностного массива для визуализации тела при сверхвысокой напряженности поля. eMagRes 2012; 1. [Google Scholar] 37. Рейковский А. Теория и конструкция катушек синтеза матрицы для магнитно-резонансной томографии. Техасский университет A&M, 1996. [Google Scholar] 38. Карлсон JW. Алогритм для реконструкции изображений ЯМР на основе нескольких катушек РЧ-приемника. Дж Магн Резон 1987. 75: 376–380.[Google Scholar] 39. Хатчинсон М, Рафф У. Быстрое получение данных МРТ с использованием нескольких детекторов. Магн Резон Мед 1988. 6: 87–91. [PubMed] [Google Scholar] 40. Коричневый RW, Ченг Ю.Н., Хааке Э.М., Томпсон MR, Венкатесан Р. Магнитно-резонансная томография — Физические принципы и дизайн последовательности, 2-е изд. Хобокен, Нью-Джерси: Уайли Блэквелл, 2014. [Google Scholar] 41. Райт AC, Лемдиасов Р, Конник Т.Дж. и др. Передающая катушка с парой Гельмгольца со встроенной приемной решеткой для МРТ трабекулярной кости с высоким разрешением в дистальном отделе большеберцовой кости при 7 Тл.Дж Магн Резон Мед 2011; 210: 113–122. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 42. Guendouz L, Гали SMOA, Hedjiedj A, Escanye J. Улучшенные катушки магнитно-резонансной томографии типа Гельмгольца с высокой однородностью B1 — сферические и эллипсоидальные четырехкатушечные системы. Концепции Магнитного Резона Часть B 2008; 33B: 9–20. [Google Scholar] 43. Смит MR, Чжай X, Курпад К.Н., Хартер Р.Д., Файн С.Б. Электромагнитная радиочастотная катушка возбуждения и приема для вмешательств на груди под контролем МРТ. Дж Магн Резон Мед 2011; 65: 1799–1804. [PubMed] [Google Scholar] 44.Гинзберг Д.М., Мельхнер MJ. Оптимальная геометрия катушек в форме седла для создания однородного магнитного поля. Rev Sci Instr 1970; 41: 122. [Google Scholar] 45. Олдермен DW, Грант DM. Эффективная конструкция катушки развязки, которая снижает нагрев проводящих образцов в сверхпроводящих спектрометрах. Дж Магн Резон 1969; 36: 447–451. [Google Scholar] 46. Болингер Л, Коляска MG, Leigh Jr JS. Многочастотная катушка с очень однородным полем B1. Дж Магн Резон 1989. 81: 162–166. [Google Scholar] 47. Вальд Л.Л., Адальштейнссон Э.Технология параллельной передачи для МРТ высокого поля. Магнитом Флэш 2009; 1: 124–135. [Google Scholar] 48. Мурбач М, Neufeld E, Кайнц В, Pruessmann KP, Кустер Н. Целостное и локальное поглощение радиочастотного излучения на моделях человека в зависимости от анатомии и положения в МР-катушке тела 1,5 Тл. Магн Резон Мед 2014; 71: 839–845. [PubMed] [Google Scholar] 49. Аткинсон IC, Рентерия Л, Бурд H, Пильскин Н.Х., Thulborn KR. Безопасность МРТ человека в статическом поле, превышающем рекомендацию FDA 8T: визуализация натрия при 9,4 Тл не влияет на жизненно важные показатели или когнитивные способности.J Магнитно-резонансная томография 2007; 26: 1222–1227. [PubMed] [Google Scholar] 50. Fujita H, Чжэн Т, Ян Х, Финнерти MJ, Handa S. РЧ катушки для поверхностных приемных матриц: искусство LC-схемы. J Магнитно-резонансная томография 2013; 38: 12–25. [PubMed] [Google Scholar] 51. Холт Д.И., Ричардс RE. Отношение сигнал / шум эксперимента ядерного магнитного резонанса. Дж Магн Резон 1976; 24: 71–85. [PubMed] [Google Scholar] 52. Холт Д.И., Лаутербур ПК. Чувствительность зеугматографического эксперимента с участием людей.Дж Магн Резон 1979; 34: 425–433. [Google Scholar] 53. Redpath TW, Уиггинс CJ. Оценка достижимого отношения сигнал / шум передающих-приемных катушек МРТ на основе измерений мощности радиочастот: приложения для контроля качества. Phys Med Biol 2000. 45: 217–227. [PubMed] [Google Scholar] 54. Хаазе А, Одой Ф, фон Кинлин М. и др. Головки зондов ЯМР для приложений in vivo. Концепции Magn Reson 2000. 61: 361–388. [Google Scholar] 56. Рейковский А, Райт С, Портер Дж. Дизайн согласующих цепей для малошумящих предусилителей.Магн Резон Мед 1995; 33: 848. [PubMed] [Google Scholar]

57. Виггинс Г.С., Коричневый R, Чжан Б. и др. Ухудшение отношения сигнал / шум в приемных массивах из-за шумовой связи предусилителя и способ его уменьшения. В: Proc 20th Annual Meeting ISMRM, Melbourne; 2012 г.

58. Вестер М, Biber S, Ренер Р, Виггинс Г.С., Коричневый R, Sodickson DK. Снижение индуктивной связи в матричных катушках за счет согласования широкополосных портов. В: Proc 20th Annual Meeting ISMRM, Melbourne; 2012 г.

59. Чжан Б, Содиксон ДК, Cloos MA.Матрицы детекторов с высоким импедансом для магнитного резонанса. Инструмент обнаружения Biol Phys 2017: 1–16. [Google Scholar] 60. Деббинс JP, Фелмли JP, Riederer SJ. Фазовое выравнивание данных с нескольких поверхностных катушек для уменьшения полосы пропускания и требований к реконструкции. Магн Резон Мед 1997; 38: 1003–1011. [PubMed] [Google Scholar] 61. Райт С.М., Wald LL. Теория и применение решетчатых катушек в МР-спектроскопии. ЯМР Биомед 1997; 10: 394–410. [PubMed] [Google Scholar] 62. Pruessmann KP, Вейгер М, Шайдеггер М.Б., Бозигер П.Смысл: кодирование чувствительности для быстрой МРТ. Магн Резон Мед 1999; 42: 952–962. [PubMed] [Google Scholar] 63. Грисволд, Массачусетс, Якоб П.М., Heidemann RM, et al. Обобщенная автокалибровка частично параллельная (GRAPPA). Магн Резон Мед 2002; 47: 1202–1210. [PubMed] [Google Scholar] 64. Блаймер М, Брейер Ф, Мюллер М. и др. РАЗБИВ, СМЫСЛ, ПИЛС, ГРАППА. Лучшая магнитно-резонансная томография 2004. 15: 223–236. [PubMed] [Google Scholar] 65. Визингер Ф, Бозигер П, Pruessmann KP. Электродинамика и максимальное SNR при параллельной МРТ.Магн Резон Мед 2004. 52: 376–390. [PubMed] [Google Scholar] 66. Вайдья М.В., Содиксон ДК, Латтанци Р. Приближение предельного внутреннего отношения сигнал / шум в однородном сферическом образце с конечным набором петлевых катушек. Концепции Магнитного Резона Часть B 2015; 44: 53–65. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 67. Король SB, Вароши С.М., Duensing GR. Оптимальное аппаратное сжатие данных SNR с использованием массива собственных катушек. Магн Резон Мед 2010; 63: 1346–1356. [PubMed] [Google Scholar] 68. Робсон П.М., Грант АК, Madhuranthakam AJ, et al.Комплексная количественная оценка отношения сигнал / шум и g-фактора для реконструкций параллельной визуализации на основе изображений и k-пространства. Магн Резон Мед 2008; 60: 895–907. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 69. Шмитт М, Поттхаст А, Сосновик Д.Е., и др. 128-канальная сердечная катушка только для приема для ускоренной МРТ сердца при 3 Тесла. Магн Резон Мед 2008; 59: 1431–1439. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

70. Грубер Б, Хендрикс А.Д., Alborahal CBS, et al. Возможности 256-канальной матричной катушки только для приема для ускоренной визуализации сердца при 3Т.В: Proc 25-е ежегодное собрание ISMRM, Гонолулу; 2017 г.

72. Рейковский А, Сэйлор С, Duensing GR. Нужна ли нам развязка предусилителя. В: Протокол 19-го ежегодного собрания ISMRM, Монреаль; 2011 г.

73. Kriegl R, Ginefri JC, Пуарье-Куино М. и др. Новый метод индуктивной развязки для гибких массивов приемопередатчиков монолитных резонаторов линии передачи. Магн Резон Мед 2015; 73: 1669–1681. [PubMed] [Google Scholar] 74. Перселл Э.М., Торри ХК, Pound RV. Резонансное поглощение ядерными магнитными моментами в твердом теле.Phys Rev 1946: 37–38. [Google Scholar] 75. Блох Ф, Хансен WW, Паккард М. Эксперимент по ядерной индукции. Phys Rev 1946: 474–485. [Google Scholar] 76. Хуршкайнен А.А., Державская Т.А., Глыбовский С.Б., и др. Элементная развязка массивов тел диполей 7 Тл метаповерхностными структурами EBG: экспериментальная проверка. Дж Магн Резон 2016; 269: 87–96. [PubMed] [Google Scholar]

77. Калоз С, Реннингс А. Обзор резонансных антенн из метаматериала. В: 3-я Европейская конференция по антеннам и распространению радиоволн, Берлин, Германия, 2009 г.

78. Сиддики MF, Реза А.В., Шафик А, Омер Х, Канесан Дж. Реализация FPGA реконструкции SENSE в реальном времени с использованием чувствительности предварительного сканирования и Emaps. Магнитно-резонансная томография 2017; 44: 82–91. [PubMed] [Google Scholar]

79. Хайд О, Вестер М, Пробка П, Хульберт П., Huish DW. Перерезание шнура — Беспроводные катушки для МРТ. В: Proc 17-е ежегодное собрание ISMRM, Гонолулу; 2009 г.

80. Скотт Джи, Ю. К. Беспроводные транспондеры для РЧ катушек: Системные вопросы. В: Proc 13-е ежегодное собрание ISMRM, Майами; 2005 г.

81. Малко Я., МакКлис Э.С., Браун ИФ, Дэвис ПК, Hoffman JC. Гибкая заполненная ртутью поверхностная катушка для МРТ. Am J Нейрорадиол 1986; 7: 246–247. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 83. Нордмайер ‐ Масснер Ж.А., Де Занче Н, Pruessmann KP. Растягиваемые катушки: применение для визуализации коленного сустава при различных углах сгибания. Магн Резон Мед 2012; 67: 872–879. [PubMed] [Google Scholar]

84. Грубер Б, Зинк С. Анатомически адаптивные локальные катушки для МРТ — Оценка растягиваемых антенн на 1.5Т. В: Proc 24-е ежегодное собрание ISMRM, Сингапур; 2016 г.

85. Венук Р.Д., Харгривз Б.А., Золото GE, Конолли С.М., Скотт Г.К. Автоматическая настройка гибких интервенционных катушек РЧ приемника. Магн Резон Мед 2005; 54: 983–993. [PubMed] [Google Scholar]

86. Рейковский А, Duensing R. Беспроводной цифровой конденсаторный модуль для настройки массивов приемных катушек. В: Proc 22-е ежегодное собрание ISMRM, Милан; 2014 г.

87. Стормонт Р, Робб Ф, Линдси С. и др. Новый взгляд на технологию гибких катушек. http: // GESIGNAPULSE.ком 2017; 69–71. 88. Бруннер Д.О., Де Занче Н, Fröhlich J, Паска Ж, Pruessmann KP. Ядерный магнитный резонанс бегущей волны. Природа 2009; 457: 994–998. [PubMed] [Google Scholar] 89. Виггинс Г.С., Коричневый R, Лакшманан К., Высокопроизводительные радиочастотные катушки для 23Na МРТ: приложения для мозга и опорно-двигательного аппарата. ЯМР Биомед 2016; 29: 96–106. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 90. Кумар А, Велти Д, Ernst RR. ЯМР-зеугматография Фурье. Дж Магн Резон 1975. 18: 69–83. [Google Scholar] 92. Webb AG. Радиочастотные микрокатушки для магнитно-резонансной томографии и спектроскопии.Дж Магн Резон 2013; 229: 55–60. [PubMed] [Google Scholar]

93. Siemens Healthcare GmbH, Магниты, спины и резонансы — Введение в основы магнитного резонанса, Эрланген: Siemens Healthcare GmbH, 2015, 160.

94. Виггинс Г.С., Triantafyllou C, Potthast A, et al. 32-канальная 3-канальная головная катушка Тесла с фазированной антенной решеткой, предназначенная только для приема, с геометрией элемента футбольного мяча. Магн Резон Мед 2006; 56: 216–223. [PubMed] [Google Scholar] 95. Stockmann JP, Витцель Т, Кейл Б. и др. Комбинированная 32-канальная матрица RF и B0 Shim Array для 3T-визуализации мозга.Магн Резон Мед 2016; 75: 441–451. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

96. Грубер Б, Кейл Б, Витцель Т, Nummenmaa A, Wald LL. 60-канальный массив ex-vivo срезов мозга для 3Т-визуализации. В: Proc 22-е ежегодное собрание ISMRM, Милан; 2014 г.

97. Доти ФД, Entzminger G, Hauck CD. Устойчивые к ошибкам РЧ-литц-катушки для ЯМР / МРТ. Дж Магн Резон 1999; 140: 17–31. [PubMed] [Google Scholar]

98. Эцель Р, Цао Х, Mekkaoui C, et al. Оптимизация конструкции и оценка 64-канальной катушки сердечного массива при 3Т.В: Протокол 23-го ежегодного собрания ISMRM, Торонто; 2015 г.

99. Юнге С. Криогенные и сверхпроводящие катушки для МРТ. eMagRes, 2012; 1. [Google Scholar]

Радиочастотное удержание в спектрометрии подвижности ионов: кажущиеся подвижности и эффективные температуры

1.

Мэй, Дж. К., Маклин, Дж. А.: Масс-спектрометрия ионной подвижности: приборы для дисперсии во времени. Анальный. Chem. 87 , 1422–1436 (2015)

CAS Статья Google ученый

2.

Утрехт, К., Барбу, И.М., Шумейкер, Г.К., ван Дуйн, Э., Хек, А.Дж.Р .: Исследование сборки вирусного капсида с помощью ионной подвижности — масс-спектрометрии. Nat. Chem. 3 , 126–132 (2011)

CAS Статья Google ученый

3.

Rabuck, J.N., Hyung, S.-J., Ko, K.S., Fox, C.C., Soellner, MB, Ruotolo, B.T .: анализ ингибитора киназы, селективный по состоянию активации, на основе масс-спектрометрии ионной подвижности. Анальный. Chem. 85 , 6995–7002 (2013)

CAS Статья Google ученый

4.

Чжоу, М., Джонс, К.М., Высоцки, В.Х .: Рассечение большого нековалентного белкового комплекса Groel с помощью поверхностно-индуцированной диссоциации и масс-спектрометрии ионной подвижности. Анальный. Chem. 85 , 8262–8267 (2013)

CAS Статья Google ученый

5.

Чжоу, М., Политис, А., Дэвис, РБ, Лико, И., Ву, К.-Дж., Стюарт, А.Г., Сток, Д., Робинсон, CV: подвижность-масса ионов спектрометрия вращающейся АТФазы выявляет АТФ-индуцированное снижение конформационной гибкости.Nat. Chem. 6 , 208–215 (2014)

CAS Статья Google ученый

6.

Д’Агостино, П.А., Шенье, К.Л .: Десорбционный электрораспылительный ионизационный масс-спектрометрический анализ фосфорорганических боевых отравляющих веществ с использованием ионной подвижности и тандемной масс-спектрометрии. Rapid Commun. Масс-спектрометрия. 24 , 1617–1624 (2010)

Артикул Google ученый

7.

Рейнольдс, Дж. К., Блэкберн, Г. Дж., Гуаллар-Хойас, К., Молл, В. Х., Бокос-Бинтинтан, В., Каур-Атвал, Г., Хоудл, Мэриленд, Гарри, Е. Л., Браун, Л. Дж., Кризер, К. С., Thomas, CLP: Обнаружение летучих органических соединений в дыхании с помощью термодесорбции, электроспрея, ионизации, подвижности ионов, масс-спектрометрии. Анальный. Chem. 82 , 2139–2144 (2010)

CAS Статья Google ученый

8.

Кампузано И., Буш М.Ф., Робинсон К.В., Бомонт, К., Ричардсон, К., Ким, Х., Ким, Х.И.: Структурная характеристика лекарственных соединений с помощью масс-спектрометрии ионной подвижности: сравнение теоретических и экспериментально полученных сечений столкновения азота. Анальный. Chem. 84 , 1026–1033 (2012)

CAS Статья Google ученый

9.

Буш, М.Ф., Холл, З., Джайлз, К., Хойес, Дж., Робинсон, К.В., Руотоло, Б.Т .: Сечения столкновений белков и их комплексов: калибровочная основа и база данных для газовых фазовая структурная биология.Анальный. Chem. 82 , 9557–9565 (2010)

CAS Статья Google ученый

10.

Литц, К. Б., Ю., К., Ли, Л .: Профилирование крупномасштабных поперечных сечений столкновений на масс-спектрометре подвижности ионов бегущей волны. Варенье. Soc. Масс-спектрометрия. 25 , 2009–2019 (2014)

CAS Статья Google ученый

11.

Hofmann, J., Hahm, H.S., Seeberger, P.Х., Пагель, К .: Идентификация аномеров углеводов с помощью масс-спектрометрии ионной подвижности. Природа 526 , 241–244 (2015)

CAS Статья Google ученый

12.

Groessl, M., Graf, S., Knochenmuss, R .: масс-спектрометрия ионной подвижности высокого разрешения для разделения и идентификации изомерных липидов. Аналитик 140 , 6904–6911 (2015)

CAS Статья Google ученый

13.

Jurneczko, E., Cruickshank, F., Porrini, M., Nikolova, P., Campuzano, IDG, Morris, M., Barran, PE: Внутреннее нарушение в белках: проблема для (не) структурной биологии, с которой сталкивается ион подвижно-масс-спектрометрия. Biochem. Soc. Пер. 40 , 1021–1026 (2012)

CAS Статья Google ученый

14.

Руотоло, Б.Т., Джайлс, К., Кампузано, И., Сандеркок, А.М., Бейтман, Р.Х., Робинсон, К.В .: Доказательства существования макромолекулярных белковых колец в отсутствие воды в объеме.Наука 310 , 1658–1661 (2005)

CAS Статья Google ученый

15.

Джайлз, К., Уильямс, Дж. П., Кампузано, И.: Улучшение разрешения подвижности ионов бегущей волны. Rapid Commun. Масс-спектрометрия. 25 , 1559–1566 (2011)

CAS Статья Google ученый

16.

Силвейра, Дж. А., Риджуэй, М. Е., Парк, М. А.: Спектрометрия подвижности захваченных ионов с высоким разрешением пептидов.Анальный. Chem. 86 , 5624–5627 (2014)

CAS Статья Google ученый

17.

Шелимов, К.Б., Клеммер, Д.Е., Хаджинс, Р.Р., Джарролд, М.Ф .: Структура белка в вакууме: газофазные конформации BPTI и цитохрома c . Варенье. Chem. Soc. 119 , 2240–2248 (1997)

CAS Статья Google ученый

18.

Кемпер, П.Р., Дюпюи Н.Ф., Бауэрс М.Т .: Новый масс-спектрометр ионной подвижности с более высоким разрешением. Int. J. Mass Spectrom. 287 , 46–57 (2009)

CAS Статья Google ученый

19.

Мэй, Дж. К., Гудвин, С. Р., Ларо, Нью-Мексико, Лептрот, К.Л., Моррис, С.Б., Курулугама, Р.Т., Мордехай, А., Кляйн, К., Барри, В., Дарланд, Э., Оверни, Г., Иматани, К., Стаффорд, Г.К., Фьелдстед, Дж. К., Маклин, Дж. А.: Конформационное упорядочение биомолекул в газовой фазе: сечения столкновения азота, измеренные на прототипе масс-спектрометра ионной подвижности с дрейфовой трубкой высокого разрешения.Анальный. Chem. 86 , 2107–2116 (2014)

CAS Статья Google ученый

20.

Дугурд П., Хаджинс Р.Р., Клеммер Д.Э., Джарролд М.Ф .: Измерения подвижности ионов с высоким разрешением. Rev. Sci. Instrum. 68 , 1122–1129 (1997)

CAS Статья Google ученый

21.

Бейкер, Э.С., Клоуэрс, Б.Х., Ли, Ф., Тан, К., Толмачев, А.В., Прайор, Д.К., Белов, М.Е., Смит, Р.Д .: Спектрометрия ионной подвижности — масс-спектрометрические характеристики с использованием электродинамических ионных воронок и повышенного давления дрейфующего газа. Варенье. Soc. Масс-спектрометрия. 18 , 1176–1187 (2007)

CAS Статья Google ученый

22.

Ибрагим, Ю.М., Бейкер, Е.С., Дэниэлсон III, В.Ф., Норхейм, Р.В., Прайор, округ Колумбия, Андерсон, Г.А., Белов, М.Э., Смит, Р.Д .: Разработка нового метода определения подвижности ионов по времени пролета. масс-спектрометр.Int. J. Mass Spectrom. 377 , 655–662 (2015)

CAS Статья Google ученый

23.

Мейсон Э.А., МакДэниел Э.У .: Транспортные свойства ионов в газах, стр. 276. Wiley, New York (1988)

24.

Revercomb, H.E., Mason, E.A .: Теория плазменной хроматографии / газового электрофореза — обзор. Анальный. Chem. 47 , 970–983 (1975)

CAS Статья Google ученый

25.

Танг, К., Шварцбург, А.А., Ли, Х.-Н., Прайор, Д.К., Бушбах, М.А., Ли, Ф., Толмачев, А.В., Андерсон, Г.А., Смит, Р.Д .: Высокочувствительная спектрометрия подвижности ионов / масс-спектрометрия с использованием электродинамических границ раздела ионных воронок. Анальный. Chem. 77 , 3330–3339 (2005)

CAS Статья Google ученый

26.

Guevremont, R., Siu, K.W.M., Wang, J., Ding, L .: Комбинированное исследование ионной подвижности / времяпролетной масс-спектрометрии ионов, генерируемых электрораспылением.Анальный. Chem. 69 , 3959–3965 (1997)

CAS Статья Google ученый

27.

Гиллиг, К.Дж., Руотоло, Б., Стоун, Э.Г., Рассел, Д.Х., Фюрер, К., Гонин, М., Шульц, А.Дж .: Связывание MALDI высокого давления с ионной подвижностью / ортогональным временем -полетная масс-спектрометрия. Анальный. Chem. 72 , 3965–3971 (2000)

CAS Статья Google ученый

28.

Герлих, Д .: В выбранном состоянии и динамика межмолекулярных реакций между состояниями. часть 1. эксперимент. Уайли, Нью-Йорк (1992)

Google ученый

29.

Ким, Т., Толмачев, А.В., Харкевич, Р., Прайор, округ Колумбия, Андерсон, Г., Удсет, Х.Р., Смит, Р.Д., Бейли, Т.Х., Раков, С., Футрелл, Дж. Х .: Разработка и внедрение новой электродинамической ионной воронки. Анальный. Chem. 72 , 2247–2255 (2000)

CAS Статья Google ученый

30.

Линн, E.C., Чанг, M.C., Хан, C.C .: Характеристика пропускающих свойств ионной воронки. Rapid Commun. Масс-спектрометрия. 14 , 2129–2134 (2000)

CAS Статья Google ученый

31.

Джавахери, Г., Томсон, Б .: Сегментированная квадрупольная ячейка столкновений только для радиочастот для измерения поперечного сечения столкновений ионов на тройном квадрупольном масс-спектрометре. Варенье. Soc. Масс-спектрометрия. 8 , 697–702 (1997)

CAS Статья Google ученый

32.

Маккаллоу, Б.Дж., Калапотакис, Дж., Иствуд, Х., Кемпер, П., Макмиллан, Д., Тейлор, К., Дорин, Дж., Барран, П.Е .: Разработка квадрупольного времяпролетного масс-спектрометра с квадрупольной подвижностью ионов. . Анальный. Chem. 80 , 6336–6344 (2008)

CAS Статья Google ученый

33.

Кови, Т., Дуглас, Д.Дж .: Сечения столкновений для ионов белка. Варенье. Soc. Масс-спектрометрия. 4 , 616–623 (1993)

CAS Статья Google ученый

34.

Гилл А.С., Дженнингс К.Р., Виттенбах Т., Бауэрс М.Т .: Конформации биополимеров в газовой фазе: новый масс-спектрометрический метод. Int. J. Mass Spectrom. 195/196 , 685–697 (2000)

CAS Статья Google ученый

35.

Thalassinos, K., Slade, SE, Jennings, KR, Scrivens, JH, Giles, K., Wildgoose, J., Hoyes, J., Bateman, RH, Bowers, MT: масс-спектрометрия ионной подвижности белков в модифицированном коммерческом масс-спектрометре.Int. J. Mass Spectrom. 236 , 55–63 (2004)

CAS Статья Google ученый

36.

Цукер С.М., Юинг М.А., Клеммер Д.Э .: Спектрометрия подвижности обертонов без сетки. Анальный. Chem. 85 , 10174–10179 (2013)

CAS Статья Google ученый

37.

Толмачев А.В., Уэбб И.К., Ибрагим Ю.М., Гаримелла С.В.Б., Чжан X., Андерсон Г.А., Смит, Р.Д .: Определение динамики ионов в структурах для манипуляций с ионами без потерь. Анальный. Chem. 86 , 9162–9168 (2014)

CAS Статья Google ученый

38.

Аллен С.Дж., Джайлз К., Гилберт Т., Буш М.Ф .: Масс-спектрометрия ионной подвижности пептидов, белков и комплексных ионов белка с использованием дрейфовой ячейки с ограничением радиочастоты. Аналитик 141 , 884–891 (2016)

CAS Статья Google ученый

39.

Аллен С.Дж., Шварц А.М., Буш М.Ф .: Влияние полярности на структуры и зарядовые состояния нативных белков и белковых комплексов в газовой фазе. Анальный. Chem. 85 , 12055–12061 (2013)

CAS Статья Google ученый

40.

Silveira, JA, Jeon, J., Gamage, CM, Pai, P.-J., Fort, KL, Russell, DH: коэффициент затухания связывает периодическую фокусировку и подвижность ионов однородного поля для точного определения столкновения. поперечные сечения.Анальный. Chem. 84 , 2818–2824 (2012)

CAS Статья Google ученый

41.

Силвейра, Дж. А., Гэмадж, К. М., Блас, Р. К., Рассел, Д. Х .: Газовая динамика ионов в ионопроводе постоянного тока с периодической фокусировкой. Int. J. Mass Spectrom. 296 , 36–42 (2010)

CAS Статья Google ученый

42.

Blase, R.C., Silveira, J.A., Gillig, K.J., Gamage, C.М., Рассел, Д. Х .: Повышенное пропускание ионов в IMS: спектрометр подвижности ионов постоянного тока с периодической фокусировкой высокого разрешения. Int. J. Mass Spectrom. 301 , 166–173 (2011)

CAS Статья Google ученый

43.

Гэмидж, К.М., Сильвейра, Дж. А., Блас, Р. К., Рассел, Д. Х .: Динамика ионов в газовой фазе в ионопроводе постоянного тока с периодической фокусировкой (Часть II): Дискретные режимы переноса. Int. J. Mass Spectrom. 303 , 154–163 (2011)

CAS Статья Google ученый

44.

Freeke, J., Bush, M.F., Robinson, C.V., Ruotolo, B.T .: Сборки белков в газовой фазе: развертывание ландшафтов и сохранение нативных структур с использованием нековалентных аддуктов. Chem. Phys. Lett. 524 , 1–9 (2012)

CAS Статья Google ученый

45.

Холл, З., Политис, А., Буш, М.Ф., Смит, Л.Дж., Робинсон, К.В.: Зависимое от заряда уплотнение и диссоциация белковых комплексов: понимание подвижности ионов и молекулярной динамики.Варенье. Chem. Soc. 134 , 3429–3438 (2012)

CAS Статья Google ученый

46.

Мейсон Э.А., МакДэниел Э.У .: В: Транспортные свойства ионов в газах, с. 149. Уайли, Нью-Йорк (1988)

Книга Google ученый

47.

Мейсон Э.А., МакДэниел Э.У .: Транспортные свойства ионов в газах, стр. 154. Уайли, Нью-Йорк (1988)

Книга Google ученый

48.

Мейсон Э.А., МакДэниел Э.У .: Транспортные свойства ионов в газах, стр. 4. Уайли, Нью-Йорк (1988)

Книга Google ученый

49.

Шварцбург А.А., Смит Р.Д .: Основы спектрометрии подвижности ионов бегущей волны. Анальный. Chem. 80 , 9689–9699 (2008)

CAS Статья Google ученый

50.

Morsa, D., Gabelica, V., De Pauw, E.: Эффективная температура ионов в спектрометрии подвижности ионов бегущей волны. Анальный. Chem. 83 , 5775–5782 (2011)

CAS Статья Google ученый

51.

Меренблум С.И., Флик Т.Г., Уильямс Э.Р .: Насколько горячие ваши ионы в спектрометрии ионной подвижности TWAVE? Варенье. Soc. Масс-спектрометрия. 23 , 553–562 (2011)

Артикул Google ученый

52.

Даль, Д .: SIMION. версия 8.0; Национальная инженерная лаборатория Айдахо: Айдахо-Фолс, ID

53.

Толмачев, А.В., Ким, Т., Удсет, Х.Р., Смит, Р.Д., Бейли, Т.Х., Футрелл, Дж. Х .: Оптимизация электродинамической ионной воронки на основе моделирования для высокочувствительная масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением. Int. J. Mass Spectrom. 203 , 31–47 (2000)

CAS Статья Google ученый

54.

Шаффер, С.А., Толмачев А., Прайор Д. К., Андерсон Г. А., Удсет Х. Р., Смит Р. Д.: Характеристика улучшенного интерфейса электродинамической ионной воронки для масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. Анальный. Chem. 71 , 2957–2964 (1999)

CAS Статья Google ученый

55.

Толмачев А.В., Чернушевич И.В., Додонов А.Ф., Стандинг К.Г .: Ионовод со столкновительной фокусировкой для соединения источника ионов атмосферного давления с масс-спектрометром.Nucl. Instrum. Методы Phys. Res. B 124 , 112–119 (1997)

CAS Статья Google ученый

56.

Шнир, П.Д., Прайс, В.Д., Джокуш, Р.А., Уильямс, E.R .: Инфракрасная радиационная диссоциация брадикинина и его аналогов с помощью черного тела: энергетика, динамика и доказательства структур соляных мостиков в газовой фазе. Варенье. Chem. Soc. 118 , 7178–7189 (1996)

CAS Статья Google ученый

57.

Марквардт Д.У .: Алгоритм оценки нелинейных параметров методом наименьших квадратов. J. Appl. Математика. 11 , 431–441 (1963)

Google ученый

Жизненный цикл биопленки и вирулентность Pseudomonas aeruginosa зависят от нитчатого профага

Аллесен-Холм М., Баркен К.Б., Ян Л., Клаузен М., Вебб Дж. С., Кьеллеберг С. и др. . (2006). Характеристика высвобождения ДНК в культурах и биопленках Pseudomonas aeruginosa . Mol Microbiol 59 : 1114–1128.

CAS Статья Google ученый

Beatson SA, Whitchurch CB, Semmler ABT, Mattick JS. (2002). Определение кворума не требуется для подергивания моторики у Pseudomonas aeruginosa . Дж Бактериол 184 : 3598–3604.

CAS Статья Google ученый

Бертани Г.(1951). Исследования лизогенеза. Дж Бактериол 62 : 293–300.

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

Bockelmann U, Lunsdorf H, Szewzyk U. (2007). Ультраструктурный и электронный спектроскопический анализ потерь энергии внеклеточного нитчатого матрикса экологического бактериального изолята. Environ Microbiol 9 : 2137–2144.

Артикул Google ученый

Boles BR, Thoendel M, Singh PK.(2004). Само-генерируемое разнообразие создает «страховые эффекты» в сообществах, где существует биопленка. Proc Natl Acad Sci USA 101 : 16630–16635.

CAS Статья Google ученый

Brockhurst MA, Buckling A, Rainey PB. (2005). Влияние бактериофага на диверсификацию условно-патогенного бактериального патогена, Pseudomonas aeruginosa . Proc Royal Soc B Biol Sci 272 : 1385–1391.

Артикул Google ученый

Bucci C, Lavitola A, Salvatore P, Del Giudice L, Massardo DR, Bruni CB et al . (1999). Гипермутация у патогенных бактерий: частые фазовые изменения у менингококков являются фенотипическим признаком специализированного биотипа-мутатора. Молекулярная ячейка 3 : 435–445.

CAS Статья Google ученый

Чикова А.К., Шаапер РМ.(2006). Мутаторные и антимутаторные эффекты продукта гена бактериофага P1 hot . J Бактериол 188 : 5831–5838.

CAS Статья Google ученый

Choi K-H, Schweizer H. (2005). Усовершенствованный метод быстрой генерации немаркированных мутантов с делецией Pseudomonas aeruginosa . BMC Microbiol 5 : 30–40.

Артикул Google ученый

Comolli JC, Hauser AR, Waite L, Whitchurch CB, Mattick JS, Engel JN.(1999). Продукты гена Pseudomonas aeruginosa Pilt и pilU необходимы для цитотоксичности in vitro и вирулентности в мышиной модели острой пневмонии. Infect Immun 67 : 3625–3630.

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

Костертон Дж. У., Стюарт П.С., Гринберг Е.П. (1999). Бактериальные биопленки: частая причина хронических инфекций. Наука 284 : 1318–1322.

CAS Статья Google ученый

Дэвис Д. (2003). Понимание устойчивости биопленок к антибактериальным средствам. Nat Rev Drug Discov 2 : 114–122.

CAS Статья Google ученый

Дэвис Д.Г., Парсек М.Р., Пирсон Дж. П., Иглевски Б. Х., Костертон Дж. В., Гринберг Е. П.. (1998). Участие межклеточных сигналов в развитии бактериальной биопленки. Наука 280 : 295–298.

CAS Статья Google ученый

Ди Пьеро М., Лу Р., Уззау С., Ван В., Маргареттен К., Паццани С. и др. . (2001). Zonula occludens анализ структуры-функции токсина. Идентификация биологически активного фрагмента на плотных контактах и ​​домена связывания рецептора зонулина. J Biol Chem 276 : 19160–19165.

CAS Статья Google ученый

Faruque SM, Zhu J, Asadulghani, Kamruzzaman M, Mekalanos JJ.(2003). Изучение разнообразных токсин-корегулируемых пилус-положительных штаммов Vibrio cholerae не продемонстрировало доказательств островного фага патогенности вибрионов. Infect Immun 71 : 2993–2999.

CAS Статья Google ученый

Fasano A, Baudry B, Pumplin DW, Wasserman SS, Tall BD, Ketley JM. (1991). Vibrio cholerae продуцирует второй энтеротоксин, который влияет на плотные контакты кишечника. Proc Natl Acad Sci USA 88 : 5242–5246.

CAS Статья Google ученый

Фуллнер К.Дж., Буше Дж.С., Ханес М.А., Хейнс III Г.К., Михан Б.М., Валхле С. и др. . (2002). Вклад дополнительных токсинов Vibrio cholerae O1 Eltor в провоспалительный ответ на модели мышиной легочной холеры. J Exp Med 195 : 1455–1462.

CAS Статья Google ученый

Hall LMC, Хендерсон-Бегг, SK.(2006). Гипермутационные бактерии, выделенные от человека — критический анализ. Микробиология 152 : 2505–2514.

CAS Статья Google ученый

Холл-Стодли Л., Костертон Дж. У., Стодли П. (2004). Бактериальные биопленки: от окружающей среды до инфекционных заболеваний. Nature Microbiol Rev 2 : 95–108.

CAS Статья Google ученый

Haussler S.(2004). Формирование биопленок фенотипом варианта малой колонии Pseudomonas aeruginosa . Environ Microbiol 6 : 546–551.

Артикул Google ученый

Haussler S, Tummler B, Weissbrodt H, Rohde M, Steinmetz I. (1999). Варианты Pseudomonas aeruginosa с небольшими колониями при муковисцидозе. Clin Infect Dis 29 : 621–625.

CAS Статья Google ученый

Hentzer M, Wu H, Andersen JB, Riedel K, Rasmussen TB, Bagge N и др. .(2003). Ослабление вирулентности Pseudomonas aeruginosa ингибиторами кворума. EMBO J 22 : 3803–3815.

CAS Статья Google ученый

Hill DF, Short NJ, Perham RN, Petersen GB. (1991). Последовательность ДНК нитчатого бактериофага Pf1. Дж Мол Биол 218 : 349–364.

CAS Статья Google ученый

Hoang TT, Karkhoff-Schweizer RR, Kutchma AJ, Schweizer HP.(1998). Система рекомбинации flp-frt с широким кругом хозяев для сайт-специфического вырезания хромосомных последовательностей ДНК: применение для выделения немаркированных мутантов Pseudomonas aeruginosa . Ген 212 : 77–86.

CAS Статья Google ученый

Hoiby N, Johansen HK, Moser C, Song ZJ, Ciofu O, Kharazmi A. (2001). Pseudomonas aeruginosa и in vitro и in vivo в режиме биопленки . Microb Infect 3 : 23–35.

CAS Статья Google ученый

Хортон Р.М., Кай З., Хо С.Н., Пис Л.Р. (1990). Сплайсинг генов путем перекрывающегося удлинения: адаптированные гены с использованием полимеразной цепной реакции. биотехнологии 8 : 528–535.

CAS PubMed Google ученый

Кенна Д.Т., Доэрти С.Дж., Фоверакер Дж., Макаскилл Л., Баркус В.А., Гован Дж.Р.(2007). Гипермутабельность в окружающей среде Pseudomonas aeruginosa и в популяциях, вызывающих легочную инфекцию у лиц с муковисцидозом. Микробиология 153 : 1852–1859.

CAS Статья Google ученый

Киров С.М., Уэбб Дж. С., О’Мэй С.Й., Рид Д.В., Ву Дж.К.К., Райс С.А. и др. . (2007). Дифференциация и распространение биопленок в мукоидных изолятах Pseudomonas aeruginosa от пациентов с муковисцидозом. Микробиология 153 : 3264–3274.

CAS Статья Google ученый

Koh KS, Lam KW, Alhede M, Queck SY, Labbate M, Kjelleberg S et al . (2007). Фенотипическая диверсификация и адаптация морфотипов Serratia marcescens MG1, полученных из биопленок. Дж Бактериол 189 : 119–130.

CAS Статья Google ученый

Льюис К.(2005). Клетки-персистеры и загадка выживания биопленок. Биохимия (Москва) В 70 : 267–274.

CAS Статья Google ученый

Май-Прохнов А., Эванс Ф., Далисей-Салудес Д., Стелцер С., Иган С., Джеймс С. и др. . (2004). Развитие биопленок и гибель клеток морской бактерии Pseudoalteromonas tunicata . Appl Environ Microbiol 70 : 3232.

CAS Статья Google ученый

McLeod SM, Kimsey HH, Davis BM, Waldor MK. (2005). CTX и Vibrio cholerae : Изучение недавно признанного типа взаимоотношений фага и клетки-хозяина. Mol Microbiol 57 : 347–356.

CAS Статья Google ученый

Миллер Р.В., Руберо В.Дж. (1984). Конверсия мукоида фагами штаммов Pseudomonas aeruginosa больных муковисцидозом. J Clin Microbiol 19 : 717–719.

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

Моллер С., Штернберг С., Андерсен Дж. Б., Кристенсен Б. Б., Рамос Дж. Л., Гивсков М. и др. . (1998). Экспрессия гена in situ в биопленках смешанных культур — свидетельство метаболических взаимодействий между членами сообщества. Appl Environ Microbiol 64 : 721–732.

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

Муидж М.Дж., Дренкард Э., Лламас М.А., Ванденбрук-Граулс CMJE, Савелкул PHM, Ausubel FM и др. .(2007). Характеристика интегрированного нитчатого фага Pf5 и его участие в формировании небольших колоний. Микробиология 153 : 1790–1798.

CAS Статья Google ученый

Накаяма К., Такашима К., Исихара Х., Шиномия Т., Кагеяма М., Каная С. и др. . (2000). Пиоцин R-типа Pseudomonas aeruginosa связан с фагом P2, а F-тип связан с фагом лямбда. Mol Microbiol 38 : 213–231.

CAS Статья Google ученый

Никас Т., Иглевски Б. (1984). Выделение и характеристика индуцированных транспозоном мутантов Pseudomonas aeruginosa , дефицитных по продукции экзофермента S. Infect Immun 45 : 470–474.

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

Pal C, Macia MD, Oliver A, Schachar I, Buckling A.(2007). Совместная эволюция с вирусами приводит к увеличению скорости бактериальных мутаций. Природа 450 : 1079–1081.

CAS Статья Google ученый

Purevdorj-Gage B, Costerton WJ, Stoodley P. (2005). Фенотипическая дифференциация и рассеяние семян в немукоидных и мукоидных биопленках Pseudomonas aeruginosa . Микробиология 151 : 1569–1576.

CAS Статья Google ученый

Rohwer F, Edwards R.(2002). Протеомное дерево фага: основанная на геноме таксономия фага. Дж Бактериол 184 : 4529–4535.

CAS Статья Google ученый

Stover CK, Pham XQ, Erwin AL, Mizoguchi SD, Warrener P, Hickey MJ et al . (2000). Полная последовательность генома Pseudomonas aeruginosa PAO1, условно-патогенного микроорганизма. Природа 406 : 959–964.

CAS Статья Google ученый

Тинсли CR, Билле Э, Нассиф Х.(2006). Бактериофаги и патогенность: больше, чем просто токсин? Microb Infect 8 : 1365–1371.

CAS Статья Google ученый

Webb JS, Lau M, Kjelleberg S. (2004). Бактериофаг и фенотипическая изменчивость в развитии биопленки Pseudomonas aeruginosa . Дж Бактериол 186 : 8066–8073.

CAS Статья Google ученый

Уэбб Дж. С., Томпсон Л. С., Джеймс С., Чарльтон Т., Толкер-Нильсен Т., Кох Б. и др. .(2003). Гибель клеток в развитии биопленки Pseudomonas aeruginosa . J Бактериол 185 : 4585–4592.

CAS Статья Google ученый

Whitchurch CB, Tolker-Nielsen T, Ragas PC, Mattick JS. (2002). Внеклеточная ДНК необходима для образования бактериальной биопленки. Наука 295 : 1487

CAS Статья Google ученый

Whiteley M, Bangera MG, Bumgarner RE, Parsek MR, Teitzel GM, Lory S и др. .(2001). Экспрессия генов в биопленках Pseudomonas aeruginosa . Природа 413 : 860–864.

CAS Статья Google ученый

Whitman WB, Coleman DC, Wiebe WJ. (1998). Прокариоты: невидимое большинство. Proc Natl Acad Sci USA 95 : 6578–6583.

CAS Статья Google ученый

Wilhelm SW, Suttle CA. ~ # Ka70o0_mzGG + C /> D} iwm_kӥ ~ + woa9> ּ].[`P) hI, 9 \ OL 쌶 L [yKaLM3, ̉B» VE \ dE`XP UơN gbI3 «» GT 2L (A] p aN42 \ ‘᪝8jT & Dz> aQoA {0 ߾ & ѻ [& ~ cZNuӭ]? w ޾7 ڿ k_t; _o Mf \ Ȕlg}% O $ r Vs? Έ ׵ [dq0L «BQB» OAKP62˄0) 5z: kP4 (! | n) HsV22UEa & 8h3 68p} -_ a (ʷV * TIQ0M M0ϲxCGP * afB> a.EƐma0NN /! Ƌ «> NCD \ (Z66E] v¦` @ A i4cK aOn’zAаFvh0T [0LL DvM˄F; a

Глутатионный катализ и механизмы реакции глутатион-зависимых ферментов

https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2012.09.018Получить права и содержание

Abstract

Предпосылки

Глутатион-зависимый катализ — это метаболическая адаптация к химическим проблемам, с которыми сталкиваются все формы жизни.В ходе эволюции природа оптимизировала многочисленные механизмы для использования глутатиона как наиболее универсального нуклеофила для превращения множества электрофильных веществ, содержащих серу, кислород или углерод.

Объем обзора

В этом всеобъемлющем обзоре обобщены фундаментальные принципы глутатионового катализа и сравниваются структуры и механизмы глутатион-зависимых ферментов, включая глутатионредуктазу, глутаредоксины, глутатионпероксидазы, пероксиредоксины, глиоксалазы 1 и 2, глутатион-трансферазы и MAPEG.Кроме того, для каждого семейства ферментов обсуждаются открытые механистические вопросы, эволюционные аспекты и физиологическое значение катализа глутатиона.

Основные выводы

Удивительно, как мало известно о многих глутатион-зависимых ферментах, как часто пренебрегают геометрией реакций и кислотно-основными катализаторами и сколько загадок механики остается нерешенными, несмотря на почти столетие исследований. С одной стороны, несколько семейств ферментов с неродственными белковыми складками распознают глутатионовый фрагмент своих субстратов.С другой стороны, тиоредоксиновый фолд часто используется для катализа глутатиона. Древние, а также недавние структурные изменения этой складки не только существенно изменили механизм реакции, но и привели к совершенно другим функциям белков.

Общее значение

Глутатион-зависимые ферменты являются отличными объектами для изучения взаимосвязей между структурой и функцией и молекулярной эволюции. Примечательно, что во времена системной биологии результаты моделей метаболизма глутатиона и окислительно-восстановительной регуляции более чем сомнительны, поскольку фундаментальные свойства ферментов не изучены и не изучены.Кроме того, некоторые из представленных механизмов могут иметь значение для разработки лекарств. Эта статья является частью специального выпуска, озаглавленного «Клеточные функции глутатиона».

Основные моменты

► Обобщены основные принципы катализа глутатиона. ► Сравниваются механизмы ферментов с пятью неродственными белковыми складками. ► Обсуждаются эволюционные аспекты и открытые механистические вопросы. ► Подчеркивается физиологическое значение катализа глутатиона.

Ключевые слова

Катализ

Глутатион

Фермент

Редокс

Тиол

Электрофил

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

Copyright © 2012 Elsevier B.V.

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Lats1 / 2 Поддерживают активацию кишечных стволовых клеток и Wnt посредством TEAD-зависимой и независимой транскрипции

https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.03.002 Получить права и контент

Основные характеристики

•

Киназы Lats1 / 2 необходимы для поддержания пути Wnt и стволовых клеток кишечника

•

Идентификация ингибитора аутопальмитоилирования TEAD позволяет проводить in vivo анализ

Ядерный YAP / TAZ взаимодействует с Groucho / TLE, чтобы блокировать транскрипцию, опосредованную TCF

•

Двойное ингибирование TEAD и Lats подавляет Myc в APC-мутированном кишечнике

Резюме

Гомеостаз кишечника строго регулируется комплексом пока плохо изучены сигнальные сети.Здесь мы демонстрируем, что Lats1 / 2, основные Hippo kinases, важны для поддержания активности пути Wnt и стволовых клеток кишечника. Делеция Lats1 / 2 ведет к потере кишечных стволовых клеток, но управляет Wnt-несвязанной экспансией крипт. Чтобы исследовать функцию факторов транскрипции нижележащих транскрипционных усиленных ассоциативных доменов (TEAD), мы идентифицировали селективный низкомолекулярный обратимый ингибитор автопальмитоилирования TEAD, который непосредственно занимает его липид-связывающий сайт и ингибирует TEAD-опосредованную транскрипцию in vivo .Комбинируя этот химический инструмент с генетическим и протеомическим подходами, мы показываем, что ингибирование кишечного Wnt с помощью делеции Lats является Yes-ассоциированным белком (YAP) / активатором транскрипции с PDZ-связывающим доменом (TAZ), зависимым, но не зависимым от TEAD. Механически ядерный YAP / TAZ взаимодействует с Groucho / Transducin-Like Enhancer of Split (TLE), чтобы блокировать транскрипцию, опосредованную Wnt / T-клеточным фактором (TCF), а двойное ингибирование TEAD и Lats подавляет активацию несвязанного Wnt Myc и эпителиальную избыточность.