II. Организация личного приема граждан. Работа приемнойФНС России 

2.1. Личный прием граждан в центральном аппарате ФНС России осуществляется на основе обращений, поступивших в письменной форме, в виде электронного запроса или устного личного обращения.

Информация о порядке личного приема граждан (место приема, условия приема, необходимые документы, контактный телефон/факс) размещается на официальном сайте ФНС России в сети Интернет, а также в административном здании ФНС России.

2.2. Заявления граждан о приеме рассматриваются Административным управлением ФНС России (далее — Административное управление) на соответствие следующим требованиям:

— просьба гражданина о личном приеме не должна быть анонимной;

— интересующий гражданина вопрос должен относиться к компетенции ФНС России;

— обращение гражданина (как устное, так и письменное), в случае необходимости, должно подкрепляться материалами и документами, обосновывающими или поясняющими суть обращения;

— представляемые гражданином материалы не должны содержать выражений, оскорбляющих честь и достоинство других лиц.

Если обращение гражданина (устное или письменное) о личном приеме не соответствует вышеприведенным требованиям, гражданину может быть отказано в личном приеме с обязательным разъяснением причины отказа.

2.3. Личный прием граждан, обратившихся непосредственно в ФНС России с целью получения устной консультации либо для предварительной записи на прием к руководителю (заместителю руководителя), ведется работником Административного управления в специально отведенном помещении — приемной ФНС России.

Прием граждан ведется по адресу: Москва, ул. Неглинная, д. 23 в рабочие дни с 10 до 17 часов (по пятницам и предпраздничным дням до 16 часов) в порядке очередности. Лица, имеющие льготы, установленные законодательством Российской Федерации, принимаются вне очереди.

2.4. При личном обращении гражданин предъявляет документ, удостоверяющий его личность. При отказе гражданина предоставить документы, удостоверяющие его личность, или документы, их заменяющие, обращение гражданина не подлежит рассмотрению и посетителю отказывается в личном приеме.

2.5. Если поставленные посетителем вопросы не входят в компетенцию ФНС России, работник приемной разъясняет гражданину его право и порядок обращения в соответствующие органы государственной власти.

2.6. При соблюдении требований, указанных в пункте 2.2 настоящего Положения, работник приемной дает устную консультацию обратившемуся гражданину, при необходимости используя установленные программные продукты и справочные правовые системы.

2.7. В случаях, когда поставленные гражданином вопросы не могут быть решены работником приемной, дальнейшая работа с заявителем проводится с привлечением работника структурного подразделения центрального аппарата ФНС России, в компетенцию которого входит рассматриваемый вопрос.

2.8. Если гражданин не удовлетворен данными ему разъяснениями, работник приемной обязан рекомендовать заявителю:

подготовить письменное обращение с изложением интересующих его вопросов для последующего рассмотрения. При необходимости работник приемной оказывает помощь в оформлении обращения;

либо записаться на личный прием к руководителю (заместителю руководителя). В этом случае предварительная запись производится непосредственно в ходе приема.

2.9. Письменные обращения граждан, принятые в ходе личного приема, регистрируются в Административном управлении с проставлением на первом листе штампа «Личный прием». По просьбе гражданина на втором экземпляре письменного обращения проставляется отметка о принятии обращения с указанием даты и входящего регистрационного номера.

Дальнейшая работа с письменным обращением ведется в порядке, установленном соответствующим разделом инструкции по делопроизводству в центральном аппарате ФНС России.

2.10. Предварительная запись на прием к руководителю (заместителю руководителя) ведется в соответствии с распределением обязанностей и установленным графиком приема граждан (приложение N 1 к Положению).

2.11. Если интересующий гражданина вопрос находится в сфере компетенции территориального налогового органа или соответствующего структурного подразделения центрального аппарата ФНС России, то гражданину, обратившемуся с просьбой о записи на прием к руководителю или заместителю руководителя, будет рекомендовано первоначально обратиться в центральный аппарат ФНС России или соответствующий территориальный налоговый орган для решения его вопроса по существу.

При невозможности решения вопроса заявителя территориальным налоговым органом или структурным подразделением центрального аппарата ФНС России, несогласии заявителя с полученным результатом рассмотрения или отказе заявителя от предложенного рассмотрения его обращения территориальным налоговым органом или структурными подразделениями центрального аппарата ФНС России, к компетенции которых относится его вопрос, гражданин записывается на прием к руководителю (заместителю руководителя).

2.12. При осуществлении предварительной записи на прием к руководителю (заместителю руководителя) содержание устного обращения вместе с другими сведениями о гражданине заносится в карточку личного приема гражданина в системе электронного документооборота (БД «Обращения граждан»).

2.13. Сведения о произведенной предварительной записи на личный прием со всеми сопутствующими материалами и документами незамедлительно направляются в секретариат руководителя или заместителя руководителя для определения даты проведения личного приема.

2.14. При определении даты приема руководитель или заместители руководителя в случае необходимости дают поручения должностным лицам соответствующих структурных подразделений центрального аппарата ФНС России о подготовке необходимых материалов по рассматриваемому вопросу к дате приема.

2.15. Дата, время и место приема граждан определяются лицом, осуществляющим прием, с учетом его рабочего плана и в срок не более 7 дней доводятся до Административного управления, которое оперативно доводит данную информацию до сведения граждан по контактным каналам связи.

Главная. Филиал ФБЛПУ «ЛРЦ «Подмосковье» ФНС России

Филиал ФБЛПУ «ЛРЦ «Подмосковье» ФНС России» представляет собой современное многопрофильное, высокоспециализированное лечебно-профилактическое учреждение, в котором оказывается амбулаторно-поликлиническая помощь взрослому населению с 18 лет.  Медицинская помощь осуществляется по 30 врачебным специальностям докторами первой и высшей категории, кандидатами медицинских наук. Для консультаций приглашаются специалисты ведущих клиник г. Москвы – доктора и кандидаты медицинских наук.

Для диагностики и лечения используется полный комплекс современных методов обследования, включая лабораторные, ультразвуковые, рентгеновские методы, а также компьютерную томографию.

Отличительной особенностью персонала Филиала ФБЛПУ «ЛРЦ «Подмосковье» ФНС России является внимательное отношение к пациентам.

Филиал ФБЛПУ «ЛРЦ «Подмосковье» ФНС России оказывает амбулаторно-поликлиническую помощь взрослому населению с 18 лет.

Филиал ФБЛПУ «ЛРЦ «Подмосковье» ФНС России предлагает следующие виды услуг:

Филиал ФБЛПУ «ЛРЦ «Подмосковье» оснащен самым передовым оборудованием: мощная материально-техническая база и высокотехнологическое оборудование позволяют проводить качественную диагностику и передовое лечение.

Медицинский персонал в своей работе использует современные достижения российских и зарубежных разработок. Специалисты владеют новейшими методиками лечения, постоянно проходят курсы повышения квалификации и участвуют в узкоспециализированных форумах. Прием ведут доктора наук, кандидаты наук, врачи высшей и первой квалификационной категорий

     Режим работы Филиала ФБЛПУ «ЛРЦ «Подмосковье» ФНС России:

     с 08:00 до 20:00 по 5-ти дневной рабочей неделе в две смены. С 01 сентября 2011 года введены рабочие субботы с 08:00 до 14:00.

У нас Вы получите не только профессиональное медицинское обслуживание, но и эмоциональную поддержку. Очень важно для пациента не бояться врача, довериться ему. И наши специалисты понимают это – врачи отнесутся к Вам с теплотой и вниманием.

Работает комиссия по медицинскому освидетельствованию водителей и комиссия по ме­дицинскому освидетельствованию на право ношения и пользования огнестрельным оружием.

Все кабинеты и отделения филиала оснащены современным медицинским оборудо­ванием, а наличие квалифицированных медицинских кадров позволяет обеспечить пациентов высококвалифицированной медицинской помощью.

У нас Вы получите не только профессиональное медицинское обслужива­ние, но и доброжелательное отношение и индивидуальный подход к каждому пациенту.

Мы находим новые способы приятно удивить своих пациентов и не жалеем для этого средств.

Сегодня Филиал ФБЛПУ «ЛРЦ «Подмосковье» ФНС России – одно из самых мощных и многопрофильных учреждений на медицинском пространстве. Уникальные медицинские аппараты последнего технологического уровня, инновационные методы профилактики заболеваний – являются лишним тому доказательством.

Филиал ФБЛПУ «ЛРЦ «Подмосковье» ФНС России – это самые передовые технологии медицины и гарантия качественного диагностического и лечебного профиля.

     Мы ждем Вас. Наши специалисты окажут помощь Вам с теплотой и вниманием!

 Многоканальный телефон: 8 (495) 670-60-64

 Фотогалерея

Что такое телефонная консультация по терапии? — Vibrant Solutions LLC

Поиск терапевта может быть немного пугающим. Вы решили обратиться к профессионалу, но существует так много профилей и веб-сайтов. Трудно сузить круг вопросов, чтобы найти кого-то, похожего на того, с кем вы хотели бы работать. Затем вы начинаете замечать, что почти в каждом профиле и веб-сайте вы видите «бесплатную 15-минутную телефонную консультацию!» Не все знают, что такое телефонная консультация, и если вы обращаетесь к терапевту из-за некоторого беспокойства, «незнание» может остановить вас.Я хотел бы помочь вам почувствовать себя более комфортно и уверенно, делая эти фантастические шаги для себя, отвечая на вопросы. Что такое телефонная консультация?

Телефонная консультация — это краткий разговор, используемый для определения того, насколько хорошо вы подходите к терапевту, с которым вы потенциально работаете. Это прекрасная возможность для терапевта узнать о вас и о том, что вы ищете, а также для вас задать любые вопросы, которые могут у вас возникнуть. Хотя каждая консультация будет немного отличаться, вот некоторые вещи, которые могут возникнуть в вашей консультации.

1. С чем вам нужна помощь.

   Это отличная тема для обсуждения, потому что она дает вам возможность поделиться кратким описанием того, что для вас сейчас происходит. Психотерапевт, с которым вы разговариваете, начнет понимать, с чем вам нужна помощь, и он может сообщить вам, есть ли у него навыки и опыт для этого! Если у них нет той специализации, которую вы ищете, они могли бы предоставить вам рекомендации тем, у кого она есть!

2. Стиль терапевта.

   Как каждый человек уникален, так и терапевты! Некоторые терапевты прямые, другие более стойкие, а третьи энергичные и веселые … стиль бесконечен! У вас есть возможность почувствовать личность терапевта по телефону, а также узнать о том, как он структурирует сеансы и какие модели или вмешательства они обычно используют с кем-то в вашей ситуации.

3. Финансовый персонал.

   В своем разговоре вы, вероятно, обсудите некоторые вещи, связанные с деньгами, например, плату за сеансы, берут ли они страховку, хотите ли вы вообще пользоваться своей страховкой и тому подобное.Не стесняйтесь задавать вопросы. Если вы решите использовать страховку, вы можете напрямую позвонить в свою страховую компанию и узнать, есть ли у вас страховое покрытие, есть ли какие-либо ограничения на количество сеансов терапии и т. Д. У вас также всегда есть возможность оплатить самостоятельно, если они не берут на себя вашу страховку и не пользуются вашими внесетевыми льготами, если они у вас есть.

4. Планирование.

   Поговорив, и вы оба решили, что это похоже на хорошее совпадение, надеюсь, есть временной интервал, который поможет вам двоим встретиться.Поскольку есть только один терапевт и много потенциальных клиентов, ваше идеальное время может быть недоступно. Творческое мышление, не говоря уже о том, чтобы уделять первоочередное внимание своему здоровью и благополучию (и, возможно, вашему месту работы), важно. Ты этого стоишь! Для большинства, если не всех людей, активное решение расставить приоритеты в терапии и работа над собой является огромной частью готовности погрузиться в работу, которая связана с саморазвитием и исцелением.

5. Следующие шаги.

   Да! У вас назначена встреча, и вы чувствуете себя прекрасно по этому поводу.Следующие шаги могут включать подтверждение времени приема, получение направления к офису и обсуждение процесса оформления входных документов. Многие терапевты просят клиентов заранее заполнить документы, чтобы получить от вас демографическую информацию и дополнительную клинически значимую информацию перед первым сеансом. Я отправляю электронное письмо с инструкциями к моему офису, а также ссылку на мой защищенный портал для пациентов, где мои клиенты могут войти в систему и заполнить документы по крайней мере за 24 часа до приема.Таким образом, я могу просмотреть его до того, как они войдут в дверь, и им не придется тратить время на его заполнение.

6. Ваши вопросы!

   Терапевты хотят ответить на любые проблемы, беспокойства и вопросы, которые могут у вас возникнуть по поводу этого процесса. Не стесняйтесь озвучивать их! Если что-то было непонятно или еще не решено, говорите 🙂

Вот и все! Как я уже упоминал, у разных терапевтов разные консультации по телефону, поэтому в вашем разговоре может быть больше или меньше вопросов, чем указано в этом списке.Надеюсь, это даст вам представление и устранит любые опасения по поводу того, что именно представляет собой эта телефонная консультация. Я лично люблю консультации по телефону, потому что это первый шаг в развитии терапевтических отношений, и многие мои клиенты сказали мне, что они действительно стали чувствовать себя лучше во время консультации! Вот почему я всегда консультируюсь по телефону с потенциальными клиентами перед тем, как записаться на первую встречу. В целом, телефонная консультация необходима, чтобы убедиться, что и вам, и терапевту нравится работать вместе в терапевтическом кабинете!

Если вы хотите поработать со мной, назначьте бесплатную 15-минутную телефонную консультацию, связавшись со мной здесь или позвонив по телефону 860-384-7626.Давай поболтаем!

Бриттани Ханкард, LMFT, лицензированный терапевт по вопросам брака и семьи в Коннектикуте и Вирджинии. Бриттани владеет частной онлайн-практикой под названием Vibrant Solutions LLC. Бриттани любит помогать умным, целеустремленным, приятным людям женщинам перейти от неуверенности в себе и перфекционизма к уверенности и ясности в своей жизни. Если вы заинтересованы в сотрудничестве с ней, нажмите здесь , чтобы получить консультацию, или позвоните по телефону 860-384-7626 .

Границы | IFN-Lambda 3 опосредует противовирусную защиту от вируса эпидемической диареи свиней, индуцируя отчетливый профиль антивирусных транскриптов в эпителии кишечника свиней

Введение

Поверхностный эпителий слизистой оболочки является основным местом проникновения большинства патогенов в организм хозяина и служит первой линией защиты от вторжения патогенов.Одним из наиболее важных противовирусных цитокинов в организме хозяина являются интерфероны (IFN), которые играют ключевую роль в подавлении вирусной инфекции (1, 2). Семейство IFN подразделяется на три различных типа: IFN типа I (IFN-α / β), IFN типа II (IFN-γ) и IFN типа III (IFN-λ). IFN типа II, который в основном продуцируется Т-клетками и естественными клетками-киллерами, оказывает ограниченное прямое противовирусное действие и играет ключевую роль в модуляции иммунного ответа хозяина (3), тогда как IFN типа I (α / β) и недавно обнаруженные IFN типа III вызывают сильное противовирусное состояние в чувствительных клетках и играют решающую роль в контроле вирусной инфекции (4-8).Хотя обычно считается, что IFN типа I являются ключевым элементом против системных инфекций, недавние исследования показали, что IFN-λ играет решающую роль в инфекциях слизистых оболочек, таких как кишечная инфекция (9, 10). В отличие от IFN типа I, которые секретируются широким спектром различных типов клеток при стимуляции, IFN типа III в основном продуцируются эпителиальными клетками, NK-клетками и дендритными клетками (DC) (8, 11-13). IFN-λ действует в основном на эпителий слизистой оболочки, что может приводить к меньшему количеству побочных эффектов по сравнению с лечением IFN типа I (8).Эти особенности делают IFN-λ потенциально лучшим противовирусным терапевтическим кандидатом против местной инфекции слизистой оболочки (7).

Хотя рецепторы для IFN типов I и III различаются, связывание IFN типов I и III с их соответствующими рецепторами стимулирует сигнальный преобразователь транскрипции (STAT) сигнального пути киназы Януса (JAK), а затем и стимуляцию этого пути. управляет транскрипцией IFN-стимулированных генов (ISG) и подталкивает клетки к антивирусному статусу (14).В соответствии со сходством индуцированных сигнальных путей, спектр генов, индуцируемых двумя типами IFNs, сильно перекрывается (2). Однако недавние исследования показали, что IFN типа III являются критическими неизбыточными противовирусными медиаторами IFNs типа I в желудочно-кишечном тракте (2). На сегодняшний день многочисленные исследования на людях или мышах использовали преимущества RNA-Seq или анализа с помощью чипов, чтобы показать, что IFN-λ и IFN-α вызывают различные нижестоящие сигнальные события, даже несмотря на то, что многие гены индуцируются как IFN типа I, так и III (15 , 16).Мыши с нокаутом рецептора IFN типа I или III испытывают более тяжелые вирусные кишечные инфекции, но мыши Ifnl ^{— / —} демонстрируют более высокую вирусную нагрузку и более серьезные клинические симптомы, чем мыши IFNAR ^{— / —} (17, 18). Исследования, проведенные Pott et al. показали, что эпителиальные клетки кишечника проявляют более сильный ответ на IFN-λ по сравнению с IFN-α / β in vivo (19, 20). Исчерпывающее понимание уникальных сигнальных профилей IFN типа I и III становится все более важным для понимания взаимодействий вирус-хозяин и разработки терапевтических средств IFN-λ.Однако до сих пор не проводилось прямого сравнительного анализа профилей транскрипции, индуцированных IFN типа I свиньи по сравнению с IFN типа III в эпителии кишечника свиней.

Диарея поросят, вызванная энтеросолюбильным коронавирусом Вирус эпидемической диареи свиней (PEDV) — очень заразное заболевание, характеризующееся водянистой диареей, обезвоживанием и вызывающей до 100% смертности новорожденных поросят. Мы и другие исследовательские группы ранее сообщали, что свиной IFN-λ приводит к лучшему подавлению инфекции PEDV по сравнению с IFN-α и что IFN-λ3 более эффективно ингибирует PEDV, чем IFN-λ1 (21–23).Однако механизмы, лежащие в основе различий между IFN-λ1, IFN-λ3 и IFN-α в ингибировании кишечного коронавируса, остаются менее ясными. Предыдущие исследования были в основном сосредоточены на профилях генов, индуцированных IFN-λ1 и IFN-α человека или мыши, но гены, вызванные IFN-λ3- и IFN-α, не сравнивались. В этом исследовании мы всесторонне сравнили профили транскрипции IFN-λ3- и IFN-α-индуцированных генов в линии эпителиальных клеток кишечника свиней (IPEC-J2) и проверили результаты RNA-Seq с помощью количественной ПЦР с обратной транскриптазой (RT-qPCR). ) in vitro , а также подтвердили различие в профиле транскрипции в энтероидах свиней, происходящих из крипт.

Материалы и методы

Клетки и вирусы

Линия эпителиальных клеток кишечника свиней J2 (IPEC-J2; любезно предоставлена ​​доктором Энтони Бликслагером, Университет штата Северная Каролина, Роли, Северная Каролина, США) поддерживалась в модифицированной смеси питательных веществ Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12) с добавлением с антибиотиками (100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина), 0,1 мМ HEPES (Gibco, США) и 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Gibco). Клетки почек африканской зеленой мартышки (Vero E6) выращивали и поддерживали в среде DMEM с добавлением антибиотиков (100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина) и 10% инактивированного нагреванием FBS (Gibco).Штамм PEDV CV777 генотипа 1 (номер доступа в GenBank KT323979) содержался в Харбинском институте ветеринарных исследований Китайской академии сельскохозяйственных наук, Харбин.

Определение противовирусных единиц (AU) IFN-λ3

Биологическая противовирусная активность рекомбинантного свиного IFN-лямбда 3, полученного из E. coli , была получена в нашей лаборатории и оценена в клетках MDBK с использованием рекомбинантного вируса везикулярного стоматита (VSV) с репортером GFP, как описано ранее (22, 24) .Единица массы-активности (Ед / мл) образцов рассчитывалась с использованием свиного прокариотического происхождения IFN-α (4,0 × 10 ⁸ Ед / мг) (Prosit Sole Biotechnology, Co., Ltd., Пекин, Китай) в качестве Справка.

Культура кишечных энтероидов свиней и среды

Крипты кишечника свиней получали из определенных свободных от патогенов поросят с использованием ранее описанных протоколов (21). Вкратце, кишечник промывали холодным PBS с антибиотиками (100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина), разрезали на 2-миллиметровые сегменты и промывали холодным PBS с антибиотиками до тех пор, пока супернатант не стал прозрачным.Промытые кусочки кишечника суспендировали в 15 мл реагента для нежной диссоциации клеток (STEMCELL, Канада) и встряхивали при 100 об / мин в течение 25 минут для диссоциации крипт при комнатной температуре (RT). Осадки кусочков кишечника суспендировали в 10 мл холодного PBS с 0,1% бычьим сывороточным альбумином (BSA) и антибиотиками (Pen-Strep) и пропускали через ячейку с ячейками размером 70 мкм. Осадки крипт собирали центрифугированием при 200 × g при 4 ° C в течение 5 мин и ресуспендировали в 10 мл холодного DMEM / F12.После подсчета кишечные крипты ресуспендировали в 25 мкл среды для выращивания органоидов IntestiCult (STEMCELL, Канада) и 25 мкл Matrigel (BD Biosciences, США) на 50 крипт и высевали в 48-луночный планшет по 50 крипт на лунку. Планшет инкубировали при 37 ° C в течение 10 мин до затвердевания матригеля. Планшет заполняли питательной средой Complete IntestiCult для органоидов и затем инкубировали при 37 ° C в инкубаторе с 5% CO ₂ . Среду культивирования меняли каждые 3–4 дня. Институциональный комитет по уходу и использованию животных Харбинского института ветеринарных исследований одобрил все протоколы, относящиеся к экспериментам на животных, проведенным в этом исследовании.

Двумерная (2D) однослойная энтероидная культура

Расширенные трехмерные энтероиды извлекали из матригеля через 7-11 дней роста путем добавления ледяной среды DMEM / F12, переносили в 15-мл пробирки и центрифугировали при 250 × g при 4 ° C в течение 5 минут. . Осадок энтероидов инкубировали в 0,25% трипсине (Gibco) в течение 5 минут при 37 ° C и диссоциировали повторным пипетированием с получением суспензии одноклеточных. DMEM-F12 с 10% (об. / Об.) FBS добавляли в суспензию отдельных клеток и смесь центрифугировали при 800 × g в течение 5 мин.Осадки клеток ресуспендировали в полной среде для роста органоидов IntestiCult при комнатной температуре и высевали по 50 энтероидов на лунку в 96-луночный планшет с предварительно нанесенным матригелем. После дифференцировки в течение 3-4 дней планарные монослои 2D энтероидов были готовы к использованию в экспериментах.

Выделение РНК и ОТ-КПЦР

экстрагировали с помощью набора Simply P Total RNA Extraction Kit (BioFlux, Китай) в соответствии с инструкциями производителя. Общую РНК (1 мкг) подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием набора PrimeScript ™ II First-Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, China).Синтезированную кДНК подвергали количественной ПЦР в трех экземплярах с использованием прибора для ПЦР в реальном времени LightCycler ^® 480 II (Roche, Швейцария) и смеси SYBR Green PCR (Life Technologies, США) в соответствии с инструкциями производителя. Все данные были получены и проанализированы с использованием программного обеспечения LightCycler ^® 480 II 1.5 на основе метода порога цикла ( ^ΔΔ CT) (25). GAPDH служил внутренним контролем. Эффективность амплификации праймеров кПЦР варьировалась от 85.83 до 106,38%. Праймеры, использованные в этом анализе, были разработаны с использованием программного обеспечения Primer Premier 5 и перечислены в таблице 1.

Таблица 1 . Последовательности праймеров для клонирования ПЦР и КПЦР.

Анализ РНК-Seq

Три биологические копии каждой из трех групп, а именно необработанные клетки IPEC-J2 (фиктивный контроль), клетки IPEC-J2, обработанные IFN-λ3 (1000 нг / мл) в течение 24 часов, или клетки IPEC-J2, обработанные IFN. -α (1000 нг / мл) в течение 24 часов были подготовлены для секвенирования РНК.Тотальную РНК очищали с использованием реагента TRIzol в соответствии с инструкциями производителя (Thermo Fisher Scientific, США). Суммарная РНК из каждого образца была определена количественно и квалифицирована с использованием биоанализатора Agilent 2100 (Agilent Technologies, США), прибора NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Inc.) и 1% агарозного геля. Один микрограмм общей РНК со значением RIN> 7 использовали для последующего конструирования библиотеки. Препараты библиотеки секвенирования нового поколения были сконструированы в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем (NEBNext ^® Ultra ™ RNA Library Prep Kit для Illumina ^® ).Выделение поли мРНК выполняли с использованием модуля магнитной изоляции NEBNext Poly (A) мРНК (NEB) или набора для удаления рРНК Ribo-Zero ™ (Illumina). Фрагментацию и праймирование мРНК выполняли с использованием буфера для реакции синтеза первой цепи NEBNext и случайных праймеров NEBNext. КДНК первой цепи синтезировали с использованием обратной транскриптазы ProtoScript II, а кДНК второй цепи синтезировали с использованием смеси ферментов синтеза второй цепи. Очищенную двухцепочечную кДНК (с помощью набора AxyPrep Mag PCR Clean-up, Axygen) затем обрабатывали смесью энзимов End Prep для восстановления обоих концов и добавления хвоста dA через одну реакцию, и продукт подвергали лигированию T-A для добавьте адаптеры на оба конца.Затем с помощью набора AxyPrep Mag PCR Clean-up (Axygen) выполняли выбор размера ДНК с лигированной адаптером и выделяли фрагменты размером ~ 360 п.н. (с приблизительным размером вставки 300 п.н.). Затем каждый образец амплифицировали с помощью ПЦР в течение 11 циклов с использованием праймеров P5 и P7, несущих последовательности, которые могут отжигаться во время мостиковой ПЦР с проточной ячейкой, и праймера P7, несущего индекс из шести оснований, чтобы обеспечить мультиплексирование. Продукты ПЦР очищали с помощью набора AxyPrep Mag PCR Clean-up (Axygen), проверяли с помощью биоанализатора Agilent 2100 (Agilent Technologies, США) и количественно оценивали с помощью Qubit 2.0 Флуорометр (Invitrogen, США). Затем библиотеки с разными индексами были мультиплексированы и загружены на прибор Illumina HiSeq (Illumina, США) в соответствии с инструкциями производителя. Секвенирование выполняли с использованием конфигурации с парным концом (PE) 2 × 150 пар оснований, а анализ изображений и определение оснований проводили с использованием HiSeq Control Software (HCS) + OLB + GAPipeline-1.6 (Illumina), поставляемого с прибором HiSeq. RNA-Seq выполняли и анализировали с помощью GENEWIZ9 (Сучжоу, Китай).

Анализ микрочипов

Анализ данных микроматрицы для идентификации дифференциально экспрессируемых генов выполняли с использованием программного обеспечения edgeR.Анализ начинается с подсчета, данные стандартизируются с помощью TMM, а затем подвергаются анализу дифференциальной экспрессии. Мы выбрали | log ₂ (кратное изменение) (logFC) | > 1 и FDR <0,05 в качестве критериев скрининга для идентификации дифференциально экспрессируемых генов.

Иммунофлуоресцентный анализ (IFA)

IPEC-J2 или Vero E6 фиксировали 4% параформальдегидом в течение 30 мин при комнатной температуре. Фиксированные клетки подвергали проницаемости 0,2% Triton X-100 в течение 20 минут при комнатной температуре и затем блокировали блокирующим буфером (PBS с 5% FBS и 5% обезжиренного молока) в течение 30 минут при 37 ° C.Затем клетки инкубировали с антителом к ​​белку PEDV N при 37 ° C в течение 2 часов и затем метили козьим антителом против IgG мыши Alexa Fluor 546 (Thermo Fisher Scientific, США) при 37 ° C в течение 1 часа. Для окрашивания ядер клеток использовали DAPI (Sigma, США). Окрашенные клетки визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа AMG EVOS F1 (Thermo Fisher Scientific, США).

Конструирование плазмид эукариотической экспрессии

Кодирующая область RSAD2 или MX2 свиньи была амплифицирована с помощью RT-PCR, и кДНК была получена с использованием набора PrimeScript ™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, China).Затем RSAD2 или MX2 амплифицировали с использованием пары праймеров, специфичных для RSAD2 или MX2 свиньи (таблица 1), соответственно. Продукты ПЦР очищали, расщепляли и клонировали в pCAGGS-HA через EcoR I и Kpn I . Конструирование плазмиды экспрессии pRSAD2 / pMX2-HA подтверждали секвенированием. Клетки Vero E6 выращивали в 48-луночных планшетах до 70-80% конфлюэнтности, а затем трансфицировали плазмидой экспрессии pRSAD2 / pMX2-HA с использованием реагента для трансфекции аттрактена (Qiagen), а экспрессию pRSAD2 / pMX2 проверяли с помощью анти-HA. ЕСЛИ.

Статистический анализ

GraphPad Prism версии 7 использовалось для анализа экспериментальных результатов. Результаты представлены в виде диаграмм разброса, на которых среднее значение указано линией. Различия между группами сравнивали с помощью непарного критерия Манна – Уитни. P <0,05 считалось значимым, а значения p- выражались следующим образом: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,005 и **** p <0.001.

Результаты

Ингибирование PEDV в клетках IPEC-J2 экзогенным IFN-λ3 превосходит ингибирование IFN-α

Согласно нашему исследованию и другим предыдущим исследованиям (21–23), IFN-λ1, IFN-λ3 и IFN-α значительно ингибируют инфекцию PEDV, но IFN-λ3 проявляет самую сильную противовирусную активность против PEDV. Чтобы подтвердить это несоответствие в противовирусной активности IFN-λ3 и IFN-α против PEDV, клетки IPEC-J2 примировали IFN-α (1000 нг / мл) или IFN-λ3 (1000 нг / мл) в течение 24 часов, а затем инфицированы PEDV (MOI = 1).В соответствии с нашими предыдущими результатами, как IFN-α, так и IFN-λ3 существенно подавляли инфекцию PEDV в клетках IPEC-J2, что продемонстрировано измерениями вирусных геномов и титров с помощью RT-qPCR (рис. 1A) и титрования TCID ₅₀ (рис. 1Б) соответственно. IFN-α уменьшал количество геномов PEDV в 24 раза, тогда как IFN-λ3 уменьшал количество геномов PEDV примерно в 342 раза. Титры вирусов соответствовали результатам геномов PEDV: титры PEDV снизились в 10 и 100 раз после предварительной обработки IFN-α или IFN-λ3 соответственно.Ингибирование инфекции PEDV как IFN-α, так и IFN-λ3 было дополнительно подтверждено с помощью IFA белка PEDV N (рис. 1C). Количество инфицированных вирусом клеток значительно уменьшилось после предварительной обработки IFN-α или IFN-λ3, тогда как количество PEDV-инфицированных клеток в группе, предварительно обработанной IFN-λ3, значительно уменьшилось, что продемонстрировано только несколькими спорадически распределенными клетками по сравнению с с теми, кто находится в группе, предварительно обработанной IFN-α. Таким образом, IFN-λ3 ограничивал инфекцию PEDV в клетках IPEC-J2 более эффективно, чем IFN-α, независимо от количественного определения вирусной РНК, инфекционности или вирусного белка (рис. 1).

Рисунок 1 . IFN-λ3 подавляет инфекцию PEDV и превосходит IFN-α в клетках IPEC-J2. (A, B) Ингибирование инфекции PEDV в клетках IPEC-J2 с помощью IFN-λ3 или IFN-α. (A) Клетки IPEC-J2 были праймированы IFN (1000 нг / мл) в течение 24 часов и инфицированы PEDV CV777 с MOI 1 и номерами вирусного генома PEDV (A) и титрами (B). при 48 hpi определяли титрованием RT-qPCR и TCID ₅₀ соответственно. Результаты представлены в виде средних значений ± SEM ( n = 3).Различия между группами сравнивали с помощью непарного критерия Манна-Уитни. P <0,05 считалось значимым, а значения p выражались следующим образом: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,005 и **** р <0,001. (C) Типичные изображения ингибирования инфекции PEDV в клетках IPEC-J2 IFN-λ3 или IFN-α. Клетки IPEC-J2 примировали IFN (1000 нг / мл) в течение 24 часов и инфицировали PEDV CV777 при MOI 1, и клетки фиксировали 4% параформальдегидом при 48 hpi, и определяли экспрессию белка PEDV N. с мышиным mAb против PEDV N (красный).DAPI использовался для окрашивания клеточных ядер (синий). Бар = 200 мкм.

IFN-λ3 индуцирует уникальный профиль транскрипции в клетках IPEC-J2 по сравнению с профилем, индуцируемым IFN-α

Для оценки основных механизмов несоответствия между ответами против PEDV, индуцированными IFN-α или IFN-λ3, мы выполнили анализ РНК-секвенирования (RNA-Seq) общей клеточной РНК, выделенной из культур клеток IPEC-J2, стимулированных с помощью IFN-α или IFN-λ3 в течение 24 ч и необработанный IFN фиктивный контроль IPEC-J2. Эта продолжительность стимуляции (24 часа) была выбрана на основе эффективности вирусного ингибирования после воздействия IFN-λ3 и IFN-α (рисунок 1) (22).Каждый из трех повторений дал более 3,89 × 10 ⁷ чистых считываний и имел более 95% Q20 (%), что указывает на надежность данных RNA-Seq. Клетки, стимулированные IFN-λ3, показали в общей сложности 997 дифференциально экспрессируемых генов, в том числе 983 гена с повышенной экспрессией и 14 генов с пониженной регуляцией, по сравнению с фиктивным контролем, тогда как IFN-α только усиливал экспрессию 122 генов из общего количества 126 генов с дифференциальной экспрессией. и снизил экспрессию четырех генов (рис. 2А).Количество генов, модифицированных IFN-λ3, было примерно в 10 раз больше, чем количество генов, модифицированных IFN-α. Эти результаты показывают, что эпителий кишечника лучше реагирует на IFN-λ3, чем на IFN-α. Далее мы сгруппировали соответствующие гены с помощью контролируемого разделения на кластеры и объединили дифференциально экспрессируемые гены, индуцированные IFN-λ3 и IFN-α, чтобы получить тепловую карту (рис. 2B) и карту venn (рис. 2C). IFN-λ3 приводил к различным профилям экспрессии генов по сравнению с профилями, индуцированными IFN-α, даже несмотря на то, что они демонстрировали значительное перекрытие (рис. 2B).Сто десять генов были усилены как в клетках, обработанных IFN-λ3, так и в IFN-α, тогда как 873 и 12 генов были однозначно повышены в присутствии IFN-λ3 и IFN-α, соответственно (рис. 2C). Ни один из генов коэкспрессии не подвергался подавлению в клетках, обработанных как IFN-λ3-, так и IFN-α, тогда как 14 и 4 гена подавлялись только в присутствии IFN-λ3 и IFN-α, соответственно. Эти результаты продемонстрировали, что IFN-λ3 индуцирует уникальный профиль транскрипции гена в эпителии кишечника по сравнению с IFN-α.

Рисунок 2 . Сравнительный анализ транскриптома клеток IPEC-J2, обработанных IFN-λ3 или IFN-α. (A) График статистических результатов дифференциальной экспрессии IFN-λ3 или IFN-α. Клетки IPEC-J2 были примированы или не примированы IFN-λ3 (1000 нг / мл) и IFN-α (1000 нг / мл) в течение 24 часов. Затем суммарную РНК, выделенную из клеток, использовали для секвенирования РНК. (B) Тепловая карта гена, экспрессированного индуцированным IFN-λ3 или IFN-α. (C) Анализ карты Venn общих дифференциально экспрессируемых генов, вызванных IFN-λ3 или IFN-α.

IFN-λ3 оказывает более сильное влияние на биологическую функцию эпителиальных клеток кишечника, чем IFN-α

Для дальнейшего прояснения функциональных последствий профилей генов, вызванных IFN-λ3 или IFN-α, мы выполнили анализ обогащения онтологией генов (GO) с использованием базы данных, созданной Консорциумом Gene Ontology, целью которой является определение и описание функций генов и белков у различных видов (рис. 3) (26). Среди 983 генов, активируемых IFN-λ3, гены 221 и 134 (22.17 и 13,44% от общего числа генов соответственно) были связаны с функцией связывания и катализом, соответственно, и эти две функции составляют основные молекулярные функциональные изменения. Доминирующими функциями IFN-α-регулируемых генов являются активность клеточного переносчика и активность фактора транскрипции, связывающего нуклеиновые кислоты, и эти функции были связаны с 40 генами (31,75% от общего числа генов) и 22 генами (17,46% от общего числа генов), соответственно. Анализ клеточных компонентов показал, что 221 дифференциально экспрессируемый ген в группе, обработанной IFN-λ3, влиял на клеточную часть, и 36 генов, связанных с этим клеточным компонентом, дифференциально экспрессировались в группе, обработанной IFN-α.Что касается биологических процессов, группа, обработанная IFN-λ3, включала 200, 173, 169, 142 и 120 дифференциально экспрессируемых генов, связанных с клеточным процессом, процессом в одном организме, биологической регуляцией, метаболическим процессом и ответом на стимул. , соответственно. Паттерн, полученный для группы, получавшей IFN-α, был аналогичен таковому в группе, обработанной IFN-λ3, и дифференциально экспрессируемые гены также были сконцентрированы на следующих пяти функциях: клеточный процесс, процесс в одном организме, биологический регуляция, метаболический процесс и реакция на раздражитель.Однако количество дифференциально экспрессируемых генов после обработки IFN-α было заметно ниже, чем после обработки IFN-λ3. Эти результаты показали, что как IFN-λ3, так и IFN-α участвуют в регуляции множества клеточных процессов в клетках IPEC-J2, таких как клеточные компоненты и молекулярные функции, но IFN-λ3 оказывает более сильное действие, чем IFN-α. Для дальнейшего изучения функции генов, специфически индуцируемых IFN-λ3, мы извлекли профили транскрипции IFN-λ3 и IFN-α в отношении биологических процессов ( p <0.01) и объединили их на основе значений –log ₁₀ ( p ), чтобы получить тепловую карту, показывающую обогащение биологических процессов (Рисунок S1). Данные продемонстрировали, что в клетках IPEC-J2 стимуляция IFN-λ3 запускает больше процессов биологических реакций, чем IFN-α, и эти процессы в основном связаны с модуляцией метаболических процессов, включая клеточные метаболические процессы, макромолекулярные метаболические процессы и первичную метаболическую регуляцию. Взятые вместе, эти результаты показывают, что дифференциально экспрессируемые гены, индуцированные IFN-λ3, участвуют в большем количестве внутриклеточных биологических процессов, чем те, которые индуцируются IFN-α.

Рисунок 3 . Анализ обогащения ГО для мишеней IFN-λ3 или IFN-α.

Обогащение пути KEGG и анализ взаимодействия дифференциально экспрессируемых генов

Чтобы изучить кластеризацию генов дифференцированной экспрессии, индуцированных IFN, в антивирусных сигнальных путях, мы выполнили анализ обогащения KEGG дифференциально экспрессируемых генов с использованием KOBAS 3.0. Обогащенный анализ KEGG показал, что дифференциально экспрессируемые гены, индуцированные IFN-λ3, участвуют в гораздо более широких сигнальных путях по сравнению с IFN-α, хотя оба они в основном модифицируют сигнальный путь NF-κB, сигнальный путь Jak-STAT, фосфоинозитид-3- киназа-Akt (PI3K-Akt) сигнальный путь, сигнальный путь митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) и сигнальный путь cGMP-PKG (рис. 4A).Чтобы определить пути передачи сигналов с участием дифференциально экспрессируемых генов, индуцированных IFN-λ3 или IFN-α, мы объединили дифференциально экспрессируемые гены и проанализировали паттерны их экспрессии (рис. 4B). Результаты показали, что дифференциально экспрессируемые гены наиболее активно участвуют в сигнальном пути Jak-STAT, за которым следуют сигнальный путь PI3K-Akt и сигнальный путь MAPK, что согласуется с выводом о том, что сигнальный путь Jak-STAT в первую очередь опосредует IFN. -индуцированные противовирусные реакции.Среди белков, кодируемых дифференциально экспрессируемыми генами, важную роль в сигнальном пути Jak-STAT играют SOS2, PIK3CA, JAK2, IL-6, SOCS4, IL-28B, STAT1, IL22RA1 и SOCS1, а KRAS, PIK3AP1, PRKAA1. , ENSSSCG00000021148, ENSSSCG00000022362 и MAP3K2 играют важную роль в сигнальном пути PI3K-Akt. Чтобы предсказать белковые взаимодействия между дифференциально экспрессируемыми генами, мы извлекли объединение дифференциально экспрессируемых генов и ввели их в веб-инструмент STRING (http: // www.string-db.org/) для создания сетей межбелкового взаимодействия (рис. 4C). Результаты анализа STRING показали, что JAK2, STAT2, PTEN, PIK3CA, IRS1, KRAS и IL6ST тесно связаны с другими белками и демонстрируют значительную дифференциальную экспрессию по сравнению с белками, индуцированными IFN-α, которые играют критическую роль в врожденной иммунный ответ, индуцированный IFN. В совокупности результаты показали, что индуцированные IFN-λ3 дифференциально экспрессируемые гены участвуют в большем количестве сигнальных путей, особенно связанных с врожденным иммунитетом, чем индуцированные IFN-α, что указывает на то, что IFN-λ3 проявляет более сильную противовирусную активность в кишечном эпителии. клетки.

Рисунок 4 . Обогащение пути KEGG и анализ взаимодействия дифференциально экспрессируемых генов, индуцированных IFN-λ3 или IFN-α. (A) Анализ обогащения пути KEGG дифференциальных генов, индуцированных IFN-λ3 или IFN-α. Дифференциальные гены, индуцированные IFN-λ3 или IFN-α, анализировали с помощью программного обеспечения kobas3.0. (B) Тепловая карта экспрессии генов дифференциальной экспрессии, индуцированных IFN-λ3 или IFN-α. Значения RPKM дифференциально экспрессируемых генов IFN-λ3 или IFN-α были извлечены, и один и тот же набор различных повторов был усреднен.Было рассчитано среднее значение RPKM всех образцов определенного гена, и тепловая карта была составлена ​​по log 10 (среднее значение RPKM определенного гена в каждой группе / среднее значение RPKM гена). Путь KEGG, которому принадлежит ген, обозначен другим символом. (C) Анализ предсказания взаимодействия белков дифференциально экспрессируемых генов с помощью базы данных строк. Соответствующие гены были введены в строку (http://www.string-db.org/), источники активного взаимодействия были выбраны в качестве гомологичных, а экспериментально определенное взаимодействие и аннотированная база данных были использованы в качестве условий для прогнозирования для прогнозирования взаимодействия белков.Толщина линии представляет собой объединенную оценку, которая представляет собой объединенную оценку результатов прогнозирования для трех условий прогнозирования, указывающую на силу поддержки данных.

IFN-λ3 индуцирует специфическую экспрессию противовирусного гена по сравнению с IFN-α

Для дальнейшего выяснения механизмов, лежащих в основе несоответствия антивирусной активности между IFN-λ3 и IFN-α, мы сосредоточили внимание на 100 основных генах, индуцированных IFN-λ3 (кратное изменение по сравнению с ложным контролем), и разделили их на три подгруппы (классические ISG). , гены, слабо индуцированные IFN-λ3, и гены, сильно индуцированные IFN-λ3), как в предыдущем исследовании (16).Экспрессия 100 главных генов во всех трех подгруппах, индуцированная IFN-λ3, была значительно выше по сравнению с экспрессией, индуцированной IFN-α (фиг. 5). ISG в классической подгруппе ISG — это прежде всего классические ISG, индуцированные IFN, о которых сообщается в литературе (16, 27). Уровни ISG в этой подгруппе, индуцированные IFN-λ3, были в 3–23 раза выше, чем уровни, индуцированные IFN-α. Подгруппа слабо индуцированных IFN-λ3 генов содержала 25 генов, в том числе три неизвестных гена (обозначенных UN1, UN2 и UN3).Анализ этой подгруппы показал, что как IFN-λ3, так и IFN-α индуцировали более чем 4-кратное увеличение экспрессии ISG по сравнению с ложным контролем. Уровни индуцированной IFN-λ3 экспрессии IFIT3, OASL, OAS1 и GBP4, которые являются важными факторами врожденного иммунитета, были в 10 раз выше, чем уровни, индуцированные IFN-α. Экспрессия 16 генов в подгруппе сильно индуцированных IFN-λ3 генов была сильно индуцирована IFN-λ3, тогда как IFN-α не вызывал значительного увеличения экспрессии (<2-кратного по сравнению с фиктивным контролем).Интересно, что радикальный S-аденозилметиониновый домен, содержащий 2 (RSAD2), многофункциональный белок с широкой противовирусной активностью, который может ингибировать как ДНК-, так и РНК-вирусы, является главным геном, активируемым IFN-λ3 (28). Напротив, IFN-α существенно не повышал экспрессию RSAD2. Некоторые другие гены (IFIT2, PARP14 и GBP6) в этой подгруппе также являются важными врожденными факторами ограничения вируса (27, 29–31). Таким образом, IFN-λ3 вызывает более сильный противовирусный врожденный иммунный ответ по сравнению с IFN-α.

Рисунок 5 . Графическое представление, показывающее анализ кратности изменения различных подгрупп генов [«классические антивирусные IFN-стимулированные гены (ISG)», «слабо индуцированные IFN-λ3 гены» и «сильно индуцированные IFN-λ3 гены»]. (A) Подгруппа классических противовирусных IFN-стимулированных генов (ISG). «Классические ISG» определялись по их обозначению в литературе. (B) Подгруппа генов, слабо индуцируемых IFN-λ3. «Слабо индуцированные IFN-λ3 гены:» кратное увеличение с помощью IFN-λ3 по сравнению с фиктивным контролем / кратное увеличение с помощью IFN-α по сравнению с фиктивным контролем> 2 и кратное увеличение с помощью IFN-α по сравнению с фиктивным контролем> 4.Неизвестные гены были названы UN1, UN2 и UN3. (C) Подгруппа сильно индуцированных IFN-λ3 генов. «Сильно индуцированные IFN-λ3 гены:» кратное увеличение с помощью IFN-λ3 по сравнению с фиктивным контролем / кратное увеличение с помощью IFN-α по сравнению с фиктивным контролем> 4 и кратное увеличение с помощью IFN-α по сравнению с фиктивным контролем <2.

RT-qPCR Проверка несоответствия в профилях транскрипции, индуцированного IFN-λ3 или IFN-α в клетках IPEC-J2, идентифицированных с помощью RNA-Seq

Чтобы проверить уникальный профиль экспрессии антивирусного гена, индуцированный IFN-λ3, который был обнаружен с помощью RNA-Seq, как показано на рисунке 5, мы случайным образом выбрали три гена из каждой группы для проверки с помощью RT-qPCR.Анализ трех подгрупп подтвердил, что IFN-λ3 наиболее существенно усиливает экспрессию ISG (фиг. 6). В частности, IFN-λ3 усиливал экспрессию больших отдельных классов ISG в классической подгруппе ISG, таких как MX2, ISG15 и IFIT3, кратные изменения ISG, индуцированные IFN-λ3, были почти в 10 раз выше, чем вызванные действием IFN-λ3. IFN-α (Фигура 6А). Анализ подгруппы генов, слабо индуцированных IFN-λ3, показал, что экспрессия OASL, OAS1 и ISG12 (A) индуцировалась как IFN-λ3, так и IFN-α на значительно разных уровнях.Изменения кратности OASL и OAS1, индуцированные IFN-λ3, были до 8 раз выше, чем изменения, вызванные IFN-α (фиг. 6B). Более существенные кратные изменения экспрессии ISG в подгруппе сильно индуцированных IFN-λ3 генов были получены с IFN-λ3 по сравнению с IFN-α, что привело только к незначительным изменениям в экспрессии (фиг. 6C). RSAD2, PLAC8 и IFIT2 в большей степени активируются IFN-λ3, чем IFN-α. В совокупности результаты in vitro RT-qPCR подтвердили, что IFN-λ3 индуцирует более сильную экспрессию ISG по сравнению с IFN-α.

Рисунок 6 . Подтверждение профилей дифференциальной экспрессии трех подгрупп индуцированных IFN-λ3 генов, индуцированных IFN-λ3 и IFN-α в клетках IPEC-J2. (A – C) Подтверждение подгруппы (A) классических ISG, (B) подгруппы слабо индуцированных IFN-λ3 генов и (C) подгруппы сильно индуцированных IFN-λ3 генов с помощью RT-qPCR . Различия между группами сравнивали с помощью непарного критерия Манна-Уитни. P <0,05 считалось значимым, а значения p выражались следующим образом: * p <0.05, ** p <0,01, *** p <0,005 и **** p <0,001.

Различные профили транскрипции в энтероидах, индуцированные IFN-λ3 или IFN-α

Энтероиды, полученные из стволовых клеток кишечных крипт, которые имитируют разнообразную клеточную природу и физиологическую активность тонкого кишечника, сохраняя при этом генетическую идентичность хозяина, составляют уникальную модель ex vivo для изучения кишечника (21, 27). Чтобы дополнительно подтвердить, был ли профиль экспрессии генов, индуцированный IFN-λ3, в энтероидах таким же, как в клетках IPEC-J2, мы стимулировали энтероиды IFN-λ3 или IFN-α в тех же условиях, что и клетки IPEC-J2, и оценили их ген. экспрессия с помощью RT-qPCR.Во всех трех группах характер экспрессии генов, индуцированных IFN-λ3 и IFN-α в энтероидах свиней, соответствовал таковому, обнаруженному в клетках IPEC-J2 (фиг. 7). В классической подгруппе ISG повышенные уровни MX2 и IFIT3, вызванные IFN-λ3, были в ~ 3-5 раз выше, чем уровни, индуцированные IFN-α (рис. 7A). Напротив, повышенные уровни OASL и OAS1, которые принадлежат к подгруппе слабо индуцированных IFN-λ3 генов, индуцированные IFN-λ3, были в 2 раза выше, чем уровни, индуцированные IFN-α, а разница кратных изменений была умеренной ( Рисунок 7B).Для сильно индуцированного IFN-λ3 гена RSAD2 и PLAC8, как мы наблюдали в других подгруппах, IFN-λ3 значительно индуцировал более высокую экспрессию, чем IFN-α (фиг. 7C). Таким образом, IFN-λ3 индуцирует более высокую экспрессию ISG, чем IFN-α, в энтероидах свиней, что позволяет предположить, что IFN-λ3 оказывает большее влияние на эпителиальные клетки желудочно-кишечного тракта, чем IFN-α.

Рисунок 7 . Проверка профилей экспрессии дифференциально экспрессируемых генов, индуцированных IFN-λ3 или IFN-α в энтероидах свиней, с помощью RT-qPCR. (A – C) Валидация (A) классическая подгруппа ISG, (B) подгруппа слабо индуцированных IFN-λ3 генов и (C) подгруппа сильно индуцированных IFN-λ3 ген с помощью RT-qPCR. Энтероиды примировали или не праймировали IFN-λ3 (1000 нг / мл) или IFN-α (1000 нг / мл) в течение 24 часов, и общую РНК из энтероидов экстрагировали и использовали для RT-qPCR. Различия между группами сравнивали с помощью непарного критерия Манна-Уитни. P <0,05 считалось значимым, а значения p выражались следующим образом: * p <0.05, ** p <0,01, *** p <0,005 и **** p <0,001.

pMX2 и pRSAD2 ингибируют инфекцию PEDV в клетках Vero E6

Мы выбрали MX2 (классический ISG) и RSAD2 (сильно индуцированный IFN-λ3 ген) среди 10 лучших генов, индуцируемых IFN-λ3, для оценки противовирусного эффекта индуцированной IFN-λ3 экспрессии ISG против инфекции PEDV. Мы клонировали свинью mx2 или rsad2 в эукариотический вектор экспрессии pCAGGS-HA, и временная экспрессия pMX2 или pRSAD2 в клетках Vero E6 была подтверждена с помощью IFA (данные не показаны).Как и ожидалось, временная сверхэкспрессия pMX2 или pRSAD2 значительно ингибировала инфекцию PEDV в клетках Vero E6, что было продемонстрировано путем измерения экспрессии вирусной РНК (Фигуры 8A, C) и белка PEDV N с помощью IFA (Фигуры 8B, D). Таким образом, эти данные указывают на то, что дифференцированно повышенная регуляция pMX2 или pRSAD2 служит важным противовирусным фактором хозяина, вызываемым IFN-λ3, против PEDV.

Рисунок 8 . Ингибирование инфекции PEDV с помощью IFN-λ3 избирательно индуцирует pMX2 или pRSAD2. (A – D) Сверхэкспрессия pMX2 или pRSAD2 ингибировала инфекцию PEDV.pMX2 или pRSAD2 клонировали и экспрессировали в эукариотическом векторе экспрессии pCAGGS-HA. Клетки Vero E6 трансфицировали pMX2 (A, B) или pRSAD2 (C, D) и pCAGGS-HA в течение 24 ч, а затем инфицировали PEDV CV777 (MOI = 1). Инфекцию PEDV определяли путем измерения геномов PEDV (A, C) и белка PEDV N (B, D) . Различия между группами сравнивали с помощью непарного критерия Манна-Уитни. P <0,05 считалось значимым, а значения p выражались следующим образом: * p <0.05, ** p <0,01, *** p <0,005 и **** p <0,001.

Обсуждение

IFN типа I и типа III, которые устанавливают клеточное противовирусное состояние и ограничивают вирусную инфекцию в организме хозяина, являются ключевыми игроками на самых ранних стадиях врожденного иммунитета против вирусной инфекции. Несмотря на сходство между эффектами двух типов IFN, все больше данных демонстрирует, что каждый класс IFN важен для противовирусной защиты хозяина и не является функционально избыточным (2).Предыдущее исследование на мышах продемонстрировало, что роль IFN-λ в функционально избыточных кишечных вирусных инфекциях не может быть компенсирована IFN-α / β (20). Следовательно, выяснение индукции клеточно-специфических сигнальных профилей IFN важно для понимания неизбыточной роли IFN-λ и IFN-α в вирусной инфекции на уровне тканей и организма. В этом исследовании мы обнаружили, что профиль транскрипции, индуцированный IFN типа III в кишечном эпителии, был уникальным по сравнению с профилем, индуцированным IFN типа I.По сравнению с IFN-α стимуляция IFN-λ3 не только приводила к более высоким уровням большинства ISG, но также значительно увеличивала разнообразие профилей генов, участвующих в различных клеточных функциях.

IFN типа I и III передают каждый сигнал через разные рецепторы гетеродимерного комплекса, чтобы инициировать множественные нисходящие сигнальные пути. Помимо активации сигнального пути Jak-STAT, IFN также активируют сигнальные каскады PI3K и MAPK (5, 32). Комбинированное использование этих сигнальных путей IFN и многими другими цитокинами может помочь объяснить различную роль IFN в регуляции противовирусных и иммунных ответов в различных средах и местах.У нас очень ограниченные знания о путях, активируемых IFN-λ, которые важны для понимания иммуномодулирующей активности IFN-λ (8). В этом исследовании мы обнаружили, что IFN-λ3 не только активирует классический противовирусный ответ Jak-STAT сигнальный путь, но также в первую очередь активирует сигнальный путь NF-κB, сигнальный путь цАМФ, сигнальный путь PI3K-Akt и сигнальный путь MAPK ( Рисунок 4). IFN-λ3 активирует гораздо больше сигнальных путей в эпителии, чем IFN-α, и это открытие может дать новое понимание механизма, посредством которого IFN-λ модулирует другие клеточные функции, помимо своей прямой противовирусной активности.IFN-λ3 в значительной степени стимулировал сигнальный путь Wnt в IEC по сравнению с IFN-α, который играет критическую роль в поддержании гомеостаза кишечного эпителия in vivo (33). Дальнейшие исследования различных сигнальных путей, индуцированных IFN-λ3 или IFN-α, помогут проанализировать сложное взаимодействие индуцированных IFN сигнальных путей с аналогичными или перекрывающимися внутриклеточными сигнальными путями, стимулируемыми другими цитокинами.

Большинство соматических клеток могут индуцировать IFN типа I и отвечать на них, но некоторые специализированные клетки, такие как клетки эпителия слизистой оболочки, избирательно продуцируют IFN типа III и отвечают на них во время различных вирусных инфекций.Мы продемонстрировали, что эпителий кишечника свиней реагирует на IFN как I, так и III типа, хотя эти IFN индуцируют разные уровни экспрессии ISG. IFN типа III включают четыре функциональных и высокогомологичных подтипа, а именно IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-λ3 и IFN-λ4 у человека. Наше и другие исследования выявили различия в противовирусной активности разных подтипов IFN-λ (22, 23, 34). IFN-λ3 превосходит или равен IFN-λ1 с точки зрения его противовирусной активности в эпителии кишечника (22) и в иммортализованной клеточной линии печени HepG2 in vitro (34).Различная кинетика и величина индукции ISG после стимуляции могут объяснять различия в противовирусной активности между различными типами или подтипами IFN. Предыдущие исследования, которые пытались идентифицировать профили генов, индуцированные IFN типа III, в основном были сосредоточены на сравнении IFN-λ1 с IFN типа I (15), и большинство этих исследований было выполнено на иммортализованных линиях клеток человека или мыши. Профиль транскрипции гена, индуцированный IFN-λ3, в частности профиль транскрипции гена, индуцированный IFN-λ3 в эпителиальных клетках кишечника свиней, не описан.Здесь мы провели сравнительный анализ профилей транскрипции, индуцированных IFN-λ3 и IFN-α в клетках кишечного эпителия свиней. Что еще более важно, в этом исследовании мы проверили результаты RNA-Seq в первичных энтероидах, полученных из крипт свиней, системе in vitro , которая хорошо воспроизводит сложную клеточность желудочно-кишечного тракта, которая демонстрирует мощный ответ как на тип I, так и на III. IFN (21, 27, 35). Дифференциальная экспрессия в IPEC-J2 или энтероидах, обнаруженная с помощью кПЦР, не связана с выбором гена домашнего хозяйства GAPDH, поскольку мы наблюдали тот же образец при использовании другого гена домашнего хозяйства актина (данные не показаны).Следовательно, изучение различий между экспрессией генов, индуцированной IFN-λ3- и IFN-α, в энтероидах более реалистично и клинически значимо.

Различная противовирусная активность IFN-λ3 и IFN-α, вероятно, связана с разной степенью индукции ISG этими двумя цитокинами, а IFN-λ3 индуцировал повышенную экспрессию ISG. Сообщалось о функциях некоторых генов, которые сильно индуцировались IFN-λ3, но функции и механизмы других генов остаются неясными. RSAD2, ген-рестриктор вируса-хозяина, демонстрировал самые высокие уровни активации после стимуляции IFN-λ3, а не IFN-α, тогда как MX1 был геном с наиболее высокой активностью после стимуляции IFN-α.Предыдущее исследование продемонстрировало, что RSAD2 свиньи эффективно ингибирует репликацию CSFV in vitro , и этот эффект может происходить за счет взаимодействия RSAD2 с белком E2 CSFV в цитоплазме (28). Наше исследование показало, что временная экспрессия RSAD2 также существенно сокращает инфицирование PEDV в клетках Vero E6 in vitro , но механизм неясен. Сообщается, что MX2, IFN-индуцированный GTP-связывающий белок (36, 37), ингибирует репликацию лентивируса ВИЧ-1, вируса иммунодефицита обезьян (SIV) и вируса инфекционной анемии лошадей (EIAV) in vitro (38, 39) .Функция свиного MX2 изучена недостаточно. Мы подтвердили, что свиной MX2 подавляет инфекцию PEDV в клетках Vero E6. Мы также обнаружили некоторые неизвестные гены, которые по-разному экспрессировались в ответ на стимуляцию IFN-λ3 или IFN-α, и это открытие может обеспечить основу для дальнейшего выяснения различных механизмов действия IFN-λ3 и IFN-α.

Таким образом, мы сравнили профили транскрипции IFN-λ3 и IFN-α в клетках IPEC-J2 и идентифицировали уникальный набор генов, которые сильно индуцировались IFN-λ3 по сравнению с IFN-α.Анализ обогащения транскрипции показал, что IFN-λ3 или IFN-α участвует в регуляции клеточных процессов, таких как клеточные компоненты и молекулярные функции, в клетках IPEC-J2, и что IFN-λ3 активирует более надежные сигнальные пути, особенно противовирусные Сигнальный путь Jak-STAT по сравнению с IFN-α. IFN-λ3 преимущественно активирует антивирусные гены в эпителиальных клетках по сравнению с IFN-α. Эти результаты показывают, что IFN-λ3 избирательно нацеливается на эпителиальные клетки тонкой кишки и вызывает неизбыточный противовирусный ответ хозяина на участке слизистой оболочки кишечника.

Заявление о доступности данных

Все наборы данных, созданные в этом исследовании, включены в рукопись / дополнительные материалы.

Заявление об этике

Исследование на животных было рассмотрено и одобрено Харбинским институтом ветеринарных исследований Китайской академии сельскохозяйственных наук, Харбин. Письменное информированное согласие было получено от владельцев на участие их животных в этом исследовании.

Взносы авторов

PL, LL и LF разработали исследования, проанализировали и интерпретировали данные.LL, MX, FF и LY провели эксперименты и получили данные. LL и PL подготовили рукопись, и все авторы внесли исправления.

Финансирование

Поддержка этой работы была оказана грантами Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая (2017YFD0501102) и Национального фонда естественных наук (31772718). Авторы несут исключительную ответственность за содержание и не обязательно отражают официальную точку зрения источников финансирования.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы благодарят доктора Сянси Пей (Северо-восточный сельскохозяйственный университет, Харбин, Китай) за помощь и советы в анализе данных RNA-Seq.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2019.02394/full#supplementary-material

Рисунок S1. Тепловая карта анализа обогащения биологического процесса профиля транскрипции IFN-λ3 и IFN-α.

Список литературы

1. Jacobs S, Zeippen C, Wavreil F, Gillet L, Michiels T. IFN-лямбда снижает инфекцию мюридного вируса герпеса-4 обонятельного эпителия, но не предотвращает реактивацию вируса в слизистой оболочке влагалища. Вирусов. (2019) 11: 757. DOI: 10.3390 / v11080757

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

3. van Boxel-Dezaire AH, Stark GR. Передача сигналов, специфичных для определенного типа клеток, в ответ на гамма-интерферон. Curr Top Microbiol Immunol. (2007) 316: 119–54. DOI: 10.1007 / 978-3-540-71329-6_7

CrossRef Полный текст | Google Scholar

4. Андреакос Э., Салагианни М., Галани И.Е., Кольцида О. Интерферон-лямбды: передовые хранители иммунитета и гомеостаза в дыхательных путях. Front Immunol. (2017) 8: 1232. DOI: 10.3389 / fimmu.2017.01232

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Джуэлл Н.А., Клайн Т., Мерц С.Е., Смирнов С.В., Флано Э., Шиндлер С. и др.Лямбда-интерферон является преобладающим интерфероном, индуцируемым вирусом гриппа A in vivo . J Virol. (2010) 84: 11515–22. DOI: 10.1128 / JVI.01703-09

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

9. Caine EA, Scheaffer SM, Arora N, Zaitsev K, Artyomov MN, Coyne CB, et al. Интерферон-лямбда защищает женский репродуктивный тракт от заражения вирусом Зика. Nat Commun. (2019) 10: 280. DOI: 10.1038 / s41467-018-07993-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

10.Леви Д.Е., Мари Эй Джей, Дурбин Дж. Индукция и функция интерферона I и III типа в ответ на вирусную инфекцию. Curr Opin Virol. (2011) 1: 476–86. DOI: 10.1016 / j.coviro.2011.11.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12. Лалле Э., Борди Л., Калиоти С., Гарбуглиа АР, Кастиллетти С., Тайби С. и др. Повышенная регуляция IFN-альфа-рецептора-1 в PBMC от пациентов, ранее не инфицированных HCV, несущих генотип cc, возможную роль IFN-лямбда. PLoS ONE. (2014) 9: e93434.DOI: 10.1371 / journal.pone.0093434

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

14. Zhou Z, Hamming OJ, Ank N, Paludan SR, Nielsen AL, Hartmann R. Интерферон III типа (IFN) индуцирует IFN-подобный ответ I типа в ограниченном подмножестве клеток через сигнальные пути с участием Jak-STAT пути и митоген-активируемые протеинкиназы. J Virol. (2007) 81: 7749–58. DOI: 10.1128 / JVI.02438-06

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

15.Кохли А., Чжан Х, Ян Дж., Рассел Р.С., Доннелли Р.П., Шейх Ф. и др. Четкие и совпадающие геномные профили и противовирусные эффекты интерферона-лямбда и -альфа на инфицированные ВГС и неинфицированные клетки гепатомы. J Viral Hepat. (2012) 19: 843–53. DOI: 10.1111 / j.1365-2893.2012.01610.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

16. Сельвакумар Т.А., Бхушал С., Калинке У., Вирт Д., Хаузер Х., Костер М. и др. Идентификация преимущественно интерферон-лямбда-индуцированного транскрипционного профиля в эпителиальных клетках кишечника мышей. Front Immunol. (2017) 8: 1302. DOI: 10.3389 / fimmu.2017.01302

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

17. Болдридж М.Т., Найс Т.Дж., МакКьюн Б.Т., Йокояма С.К., Камбал А., Вхедон М. и др. Комменсальные микробы и интерферон-лямбда определяют стойкость кишечной норовирусной инфекции мышей. Наука. (2015) 347: 266–9. DOI: 10.1126 / science.1258025

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

18. Douam F, Soto Albrecht YE, Hrebikova G, Sadimin E, Davidson C, Kotenko SV, et al.Опосредованная интерфероном передача сигналов типа III имеет решающее значение для борьбы с живым аттенуированным вирусом желтой лихорадки in vivo . МБио. (2017) 8: e00819–17. DOI: 10.1128 / mBio.00819-17

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

19. Odendall C, Dixit E, Stavru F, Bierne H, Franz KM, Durbin AF, et al. Различные внутриклеточные патогены активируют экспрессию интерферона III типа из пероксисом. Nat Immunol. (2014) 15: 717–26. DOI: 10.1038 / ni.2915

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

20. Pott J, Mahlakoiv T, Mordstein M, Duerr CU, Michiels T, Stockinger S, et al. IFN-лямбда определяет противовирусную защиту кишечного эпителия хозяина. Proc Natl Acad Sci USA. (2011) 108: 7944–9. DOI: 10.1073 / pnas.1100552108

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

21. Ли Л., Фу Ф, Го С., Ван Х, Хе Х, Сюэ М. и др. Кишечные энтероиды свиней: новая модель для изучения кишечного коронавируса, вирусной инфекции эпидемической диареи свиней и врожденной реакции организма хозяина. J Virol. (2019) 93: e01682–18. DOI: 10.1128 / JVI.01682-18

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

22. Ли Л., Фу Ф, Сюэ М., Чен В., Лю Дж, Ши Х и др. IFN-лямбда предпочтительно ингибирует PEDV-инфекцию эпителиальных клеток кишечника свиней по сравнению с IFN-альфа. Antiviral Res. (2017) 140: 76–82. DOI: 10.1016 / j.antiviral.2017.01.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

23. Чжан К., Ке Х, Бликслагер А., Фудзита Т., Ю Д.Ограничение интерферона типа III вирусом эпидемической диареи свиней и роль вирусного белка nsp1 в передаче сигналов IRF1. J Virol. (2018) 92: e01677–17. DOI: 10.1128 / JVI.01677-17

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

24. Чен В., Цао В., Чжао Х., Ху К., Цюй Л., Ху С. и др. Создание стабильной клеточной линии СНО с высоким уровнем экспрессии рекомбинантного свиного IFN-бета. Цитокин. (2011) 54: 324–9. DOI: 10.1016 / j.cyto.2010.12.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

26.Эшбернер М., Болл С.А., Блейк Дж. А., Ботштейн Д., Батлер Н., Черри Дж. М. и др. Генная онтология: инструмент для объединения биологии. Консорциум генных онтологий. Nat Genet. (2000) 25: 25–9. DOI: 10.1038 / 75556

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

27. Ким Б. Х., Шеной А. Р., Кумар П., Дас Р., Тивари С., МакМикинг Д. Д.. Семейство ИФН-гамма-индуцибельных ГТФаз массой 65 кДа защищает от бактериальной инфекции. Наука. (2011) 332: 717–21. DOI: 10.1126 / наука.1201711

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

28. Ли В., Мао Л., Цао И, Чжоу Б., Ян Л., Хан Л. и др. Белок свиного виперина подавляет репликацию вируса классической чумы свиней (CSFV) in vitro . Вирол Дж. (2017) 14: 202. DOI: 10.1186 / s12985-017-0868-4

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

29. Chen L, Zhai W., Zheng X, Xie Q, Zhou Q, Tao M, et al. Снижение экспрессии IFIT2 способствует прогрессированию рака желудка и предсказывает плохой прогноз для пациентов. Cell Physiol Biochem. (2018) 45: 15–25. DOI: 10.1159 / 000486219

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

30. Дэвис Б.М., Фенстерл В., Лоуренс Т.М., Худачек А.В., Сен Г.К., Шнелл М.Дж. Ifit2 является фактором ограничения патогенности вируса бешенства. J Virol. (2017) 91: e00889–17. DOI: 10.1128 / JVI.00889-17

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

31. Швейкер С.С., Таубер А.Л., Шерри М.Э., Левонис С.М. Структура, функция и ингибирование поли (АДФ-рибоза) полимеразы, член 14 (PARP14). Mini Rev Med Chem. (2018) 18: 1659–69. DOI: 10.2174 / 1389557518666180816111749

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

33. Ootani A, Li X, Sangiorgi E, Ho QT, Ueno H, Toda S, et al. Поддерживаемая культура эпителия кишечника in vitro и в нише Wnt-зависимых стволовых клеток. Nat Med. (2009) 15: 701–6. DOI: 10,1038 / нм.1951

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

34. Деллгрен К., Гад Х. Х., Хэмминг О. Дж., Мельхьорсен Дж., Хартманн Р.Человеческий интерферон-лямбда3 является мощным членом семейства интерферонов III типа. Genes Immun. (2009) 10: 125–31. DOI: 10.1038 / gene.2008.87

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

35. Болдридж М. Т., Ли С., Браун Дж. Дж., Макаллистер Н., Урбанек К., Дермоди Т. С. и др. Экспрессия Ifnlr1 на эпителиальных клетках кишечника имеет решающее значение для противовирусных эффектов интерферона лямбда против норовируса и реовируса. J Virol. (2017) 91: e02079–16. DOI: 10.1128 / JVI.02079-16

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

36. Эби М., Фах Дж., Хёрт Н., Самуэль С.Е., Томис Д., Баззигер Л. и др. Структуры кДНК и регуляция двух индуцированных интерфероном белков Mx человека. Mol Cell Biol. (1989) 9: 5062–72. DOI: 10.1128 / MCB.9.11.5062

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

37. Мелен К., Кескинен П., Ронни Т., Саренева Т., Лоунатмаа К., Джулкунен И. Человеческий белок MxB, интерферон-альфа-индуцируемая ГТФаза, содержит сигнал ядерного нацеливания и локализуется в области гетерохроматина под ядерной оболочкой. J Biol Chem. (1996) 271: 23478–86. DOI: 10.1074 / jbc.271.38.23478

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

38. Ji S, Na L, Ren H, Wang Y, Wang X. Белок устойчивости к миксовирусу лошадей 2 ограничивает лентивирусную репликацию, блокируя ядерное поглощение капсидного белка. J Virol. (2018) 92: e00499–18. DOI: 10.1128 / JVI.00499-18

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

39. Лю З., Пань Ц., Дин С., Цянь Дж., Сюй Ф., Чжоу Дж. И др.Интерферон-индуцируемый белок MxB подавляет инфекцию ВИЧ-1. Клеточный микроб-хозяин. (2013) 14: 398–410. DOI: 10.1016 / j.chom.2013.08.015

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

BRCA1 регулирует передачу сигналов IFN-γ посредством механизма, включающего IFN типа I

Abstract

BRCA1 кодирует ген-супрессор опухоли, который мутирован в зародышевой линии женщин с генетической предрасположенностью к раку груди и яичников. BRCA1 участвует в ряде важных клеточных функций, включая восстановление повреждений ДНК, регуляцию транскрипции, контроль клеточного цикла и убиквитинирование.Используя микроматрицу Affymetrix U95A, IRF-7 был идентифицирован как транскрипционная мишень BRCA1, а также было показано, что он синергетически активируется BRCA1, особенно в присутствии IFN-γ, что совпадает с синергической индукцией апоптоза. Мы показываем, что BRCA1, преобразователь сигнала и активатор транскрипции (STAT) -1 и STAT2 все необходимы для индукции IRF-7 после стимуляции IFN-γ. Мы также показываем, что индукция IRF-7 с помощью BRCA1 и IFN-γ зависит от IFN типа I, IFN-α и IFN-β.Мы показываем, что BRCA1 необходим для активации STAT1, STAT2 и IFN типа I в ответ на IFN-γ. Мы показываем, что BRCA1 локализован на промоторах молекул, участвующих в передаче сигналов IFN типа I, что приводит к их положительной регуляции. Блокирование этой промежуточной стадии IFN типа I с использованием специфической антисыворотки показывает потребность в IFN-α и IFN-β для индукции IRF-7 и апоптоза. Наконец, мы описываем механизм регуляции BRCA1 / IFN-γ генов-мишеней, участвующих в врожденном иммунном ответе, который зависит от передачи сигналов IFN типа I.(Mol Cancer Res 2007; 5 (3): 261–70)

• BRCA1
• IFN-γ
• IRF-7
• IFNs типа I
• Апоптоз

Введение

BRCA1 был впервые идентифицирован как один из генов, предрасполагающих к раннему началу рака груди и яичников (1). Мутация BRCA1 увеличивает риск 65% для развития рака груди и 39% для развития рака яичников к возрасту 70 лет (2). Мутации BRCA1 в зародышевой линии обнаруживаются примерно в 80% родословных с раком груди и яичников и у примерно 10% женщин с ранним началом рака молочной железы независимо от семейного анамнеза (3).Другие сообщения предполагают, что BRCA1 также может играть важную роль в спорадической форме заболевания, поскольку до 30% спорадических раковых заболеваний молочной железы демонстрируют сниженные уровни экспрессии белка BRCA1 (4).

BRCA1 участвует в ряде клеточных функций, включая ответ на повреждение ДНК, регуляцию клеточного цикла, убиквитинирование и регуляцию транскрипции (рассмотрено в ссылке 5). Однако точная роль BRCA1 в регуляции транскрипции полностью не определена. Первое доказательство роли в транскрипции было получено в исследованиях на дрожжах, в которых слияние COOH-концевого домена BRCA1 с ДНК-связывающим доменом Gal4 приводило к активации репортерной конструкции Gal4.Эта активация отменялась при введении связанных с заболеванием мутаций в COOH-концевом домене, а также при делеции последних 11 аминокислот BRCA1 (6-8). Эти результаты подтверждаются наблюдением, что COOH-концевой домен BRCA1 имеет высокую кислотность, что является общей чертой факторов транскрипции (9). Однако с использованием дрожжевой одногибридной системы было показано, что BRCA1 сам по себе не может связываться с ДНК специфическим для последовательности образом, что ставит под сомнение роль BRCA1 как классического фактора транскрипции (10).

Ранее было показано, что модуляция уровней экспрессии BRCA1 приводит как к повышающей, так и понижающей регуляции ряда генов. Активизированные гены включали индуцируемый стрессом и повреждением ДНК ген GADD45 (11, 12) и ингибитор прогрессирования клеточного цикла p21WAF1 / cip1 (13), тогда как BRCA1 репрессировал опосредованную эстрогеном транскрипцию (14, 15). BRCA1 может также связываться с большим количеством хорошо описанных факторов транскрипции, включая p53, сигнальный преобразователь и активатор транскрипции (STAT) -1, c-Myc, а также коактиваторы и репрессоры, такие как COOH-концевой связывающий белок и COOH-концевой белок. связывающий белок — взаимодействующий белок.Взаимодействуя с этими факторами транскрипции, BRCA1 может модулировать их функцию трансактивации и тем самым влиять на экспрессию последующих генов-мишеней (16-20).

Недавно было высказано предположение, что BRCA1 является компонентом холоферментного комплекса РНК-полимеразы II, основываясь на наблюдении, что он ассоциируется с РНК-геликазой A (21, 22). BRCA1 может также привлекать другие ключевые молекулы, участвующие в ремоделировании хроматина и доступности промоторов, такие как гистондеацетилаза 1, гистондеацетилаза 2 и комплексы SWI / SNF (23, 24).В целом, эти наблюдения указывают на роль BRCA1 как коактиватора или корепрессора транскрипции благодаря его способности связываться как с холоферментом РНК-полимеразы II, так и с множественными факторами транскрипции.

В попытке идентифицировать новые транскрипционные мишени BRCA1 мы выполнили профили экспрессии на основе микрочипов с использованием тетрациклин-зависимой BRCA1-индуцибельной клеточной линии MBR62-bcl2 (25). Мы определили панель ранее описанных IFN-регулируемых генов, которые активируются после индуцибельной экспрессии BRCA1.К ним относятся IFN-индуцированный фактор транскрипции IRF-7 (6-кратный), антивирусная GTPase MxA (8-кратная), IFN-индуцированный белок, участвующий в ингибировании трансляции, ISG54 (3-кратный) и белок-переносчик, называемый TAP1. , который, как известно, участвует в презентации антигена MHC класса I (2 раза; ссылка 25). Впоследствии мы показали, что часть этих генов синергетически активируется BRCA1 в присутствии IFN-γ, но не IFN-α или IFN-β, и что BRCA1 является ключевым медиатором индуцированного IFN-γ апоптоза.Мы показали, что IRF-7 синергетически индуцировался BRCA1 в присутствии IFNγ и что IRF-7 может функционировать как эффектор BRCA1 / IFN-γ-опосредованного апоптоза. Это исследование сосредоточено на определении механизма, с помощью которого BRCA1 регулирует чувствительные к IFN-γ гены-мишени. Мы показываем, что для индукции целевых генов, таких как IRF-7 , требуется промежуточный этап с участием IFN типа I. Мы обнаружили, что BRCA1 необходим для повышения регуляции STAT1, STAT2 и IFN типа I в ответ на IFN-γ, примирования клетки для последующей вторичной аутокринной стимуляции IFN-α и IFN-β.Наконец, мы предлагаем механизм, посредством которого BRCA1 и IFN-γ взаимодействуют для индукции экспрессии целевых генов, таких как IRF-7 , для стимуляции врожденного иммунного ответа и индукции апоптоза.

Результаты

BRCA1 необходим для индукции IRF-7 с помощью IFN-γ и апоптоза

Мы идентифицировали IRF-7, ранее описанный ген, индуцируемый IFN, в качестве транскрипционной мишени BRCA1 с помощью профилирования экспрессии на основе микрочипов. Чтобы продемонстрировать потребность в BRCA1 для индукции IRF-7, мы использовали две модели комплементарных клеточных линий: ( a ) клетки MBR62-bcl2 с индуцибельной экспрессией экзогенного BRCA1 и ( b ) нокдаун эндогенного BRCA1 путем небольшого вмешательства. РНК (миРНК) в клеточной линии T47D (рис.1A и B , соответственно). Обе модели показали потребность в BRCA1 для индукции IRF-7 IFN-γ. Мы также ранее сообщали, что BRCA1 усиливает апоптоз в клетках MBR62-bcl2 в ответ на IFN-γ (25). Эта потребность в BRCA1 была также показана в этом исследовании, в котором мы наблюдали полное ингибирование апоптоза в клетках T47D с помощью IFN-γ после siRNA, направленной против BRCA1 (рис. 1C).

Требования к BRCA1 для индукции IRF-7 под действием IFN-γ. A. Нозерн-блоттинг, показывающий BRCA1-опосредованную индукцию IRF-7 в клетках MBR62-bcl2. Клетки культивировали в присутствии (+ tet, BRCA1 off) или в отсутствие (-tet, BRCA1 on) тетрациклина, а затем либо оставляли без обработки, либо обрабатывали 100 ед. / Мл IFN-γ в течение 24 часов. Нозерн-блоты гибридизовали с зондом кДНК для BRCA1 ( вверху, ) или IRF-7 (, средний ) и повторно зондировали с зондом кДНК для GAPDH в качестве контроля загрузки ( внизу, ). B. Иммунопреципитация ( IP ) — Вестерн-блот-анализ ( верхний ) или Нозерн-блот-анализ ( средний ), показывающий потребность в BRCA1 в индукции IRF-7 IFN-γ в клетках T47D.Клетки предварительно обрабатывали олигонуклеотидами siRNA ( Scr ) или BRCA1 siRNA ( siB ) и либо оставляли без обработки, либо обрабатывали 100 ед. / Мл IFN-γ в течение 24 часов. Мембраны Нозерн-блоттинга гибридизовали с зондами кДНК для IRF-7 (, средний, ) и GAPDH в качестве контроля загрузки (, нижний, ). C. Вестерн-блот-анализ, показывающий потребность в BRCA1 для индукции апоптоза IFN-γ в клетках T47D. Клетки предварительно обрабатывали скремблированной миРНК или олигонуклеотидами миРНК BRCA1, а затем либо оставляли без обработки, либо обрабатывали 100 ед. / Мл IFN-γ в течение 24 часов.Блот анализировали на наличие расщепленной каспазы-3 ( вверху, ) и GAPDH в качестве контроля загрузки ( внизу, ).

Для индукции IRF-7 с помощью IFN-γ требуются как STAT1, так и STAT2

Наша главная цель состояла в том, чтобы определить потенциальный механизм, посредством которого BRCA1 регулирует транскрипционный контроль генов IFN. Поэтому мы исследовали роль двух основных факторов транскрипции, участвующих в передаче сигналов IFN (т.е. STAT1 и STAT2). Чтобы оценить потребность в STAT1 и STAT2 для IFN-γ-опосредованной индукции IRF-7, эндогенная экспрессия обоих STAT ингибировалась siRNA в клетках T47D (рис.2A и B , соответственно). Подтвердив нокдаун siRNA STAT1 и STAT2 с помощью вестерн-блоттинга ( верхние строки ), анализ Нозерн-блоттинга показал значительное снижение уровней IRF-7 в ответ на IFN-γ ( третьи строки ). После индукции BRCA1 в BRCA1-индуцибельных клетках MBR62-bcl2 (рис. 2C и D, верхние строки ) мы могли показать, что siRNA STAT1 и STAT2 отменяли индукцию IRF-7 в ответ на IFN-γ (рис. 2C и D, средние ряды ). Эти результаты подтвердили, что и STAT1, и STAT2 необходимы для индукции IRF-7 в ответ на IFN-γ.

Для индукции IRF-7 с помощью IFN-γ требуются как STAT1, так и STAT2. A. Вестерн-блот-анализ (, два верхних ряда, ), показывающий siRNA-опосредованное ингибирование эндогенного STAT1 в клетках T47D. Клетки предварительно обрабатывали либо скремблированной миРНК, либо олигонуклеотидами миРНК STAT1 ( Si1 ) и либо оставляли без обработки, либо обрабатывали 100 ед. / Мл IFN-γ в течение 24 часов. Мембраны вестерн-блоттинга исследовали на наличие STAT1 (, верхний ряд, ) и GAPDH в качестве контроля загрузки (, второй ряд, ).Два нижних ряда, анализ Нозерн-блоттинга, показывающий потребность в STAT1 для индукции IRF-7 под действием IFN-γ в клетках T47D. Нозерн-блоты проводили с РНК, одновременно собранной из того же эксперимента (как для A ), и гибридизировали с зондами кДНК для IRF-7 ( третий ряд ) и GAPDH в качестве контроля загрузки ( нижний ряд ). B. Вестерн-блот-анализ (, два верхних ряда, ), показывающий siRNA-опосредованное ингибирование STAT2. Клетки T47D предварительно обрабатывали либо скремблированной siRNA, либо олигонуклеотидами siRNA STAT2 ( Si2 ) и оставляли без обработки или обрабатывали 100 ед. / Мл IFN-γ в течение 24 часов.Мембраны вестерн-блоттинга анализировали на наличие STAT2 (, верхний ряд, ), и GAPDH использовали в качестве контроля загрузки (, второй ряд, ). Два нижних ряда, Нозерн-блот-анализ, показывающий потребность в STAT2 для индукции IRF-7 с помощью IFN-γ. Клетки T47D предварительно обрабатывали скремблированной миРНК или олигонуклеотидами миРНК STAT2 и оставляли без обработки или обрабатывали 100 ед. / Мл IFN-γ в течение 24 часов. Нозерн-блоты гибридизовали с зондами кДНК для IRF-7 (, третий ряд, ) и GAPDH в качестве контроля загрузки (, нижний ряд, ). C. Нозерн-блот-анализ, показывающий потребность в STAT1 для индукции IRF-7 BRCA1 и IFN-γ в клетках MBR62-bcl2. Нозерн-блоттинг проводили с РНК, собранной из клеток, предварительно обработанных либо скремблированной миРНК, либо олигонуклеотидами миРНК STAT1 и выращенных в присутствии или в отсутствие тетрациклина с 100 ед. / Мл IFN-γ в течение 24 ч и гибридизированных с зондами кДНК для BRCA1 ( верхний ряд ) или IRF-7 ( средний ряд ) и GAPDH в качестве контроля загрузки ( нижний ряд ). D. Нозерн-блот-анализ, показывающий потребность в STAT2 для индукции IRF-7 с помощью BRCA1 и IFN-γ в клетках MBR62-bcl2. Нозерн-блоттинг проводили с РНК, собранной из клеток, предварительно обработанных либо скремблированной миРНК, либо олигонуклеотидами миРНК STAT2 и выращенных в присутствии или в отсутствие тетрациклина с 100 ед. / Мл IFN-γ в течение 24 ч и гибридизированных с зондами кДНК для BRCA1 ( верхний ряд ) или IRF-7 ( средний ряд ) и GAPDH в качестве контроля загрузки ( нижний ряд ).

BRCA1 необходим для повышения регуляции STAT1 и STAT2 в ответ на IFN-γ

В многочисленных публикациях сообщалось, что одним из эффектов IFN-γ является повышенная регуляция компонентов системы IFN, включая STAT1. и STAT2 (26). Поскольку мы показали, что и STAT1, и STAT2 участвуют в индукции IRF-7, мы также хотели исследовать роль BRCA1 в регуляции STAT1 и STAT2 после лечения IFN-γ. Для этого мы использовали подход siRNA, с помощью которого мы могли сначала показать, что BRCA1 блокируется siRNA (рис.3A и B, верхние ряды ), а затем, что BRCA1 необходим для активации STAT1 и STAT2 в ответ на IFN-γ в клетках T47D (фиг. 3A и B, средние строки ). Было ясно, что уровни обоих STAT в значительной степени индуцировались IFN-γ, эффект, который полностью аннулировался миРНК BRCA1. На этом этапе мы предположили, что BRCA1 может функционировать на уровне промоторов STAT1 и STAT2, чтобы оптимально трансактивировать эти молекулы STAT после стимуляции IFN-γ.Чтобы проверить эту теорию, эксперименты по иммунопреципитации хроматина были проведены на клетках T47D до и после стимуляции IFN-γ. Обработка IFN-γ не повлияла на ассоциацию РНК-полимеразы II ни с промоторами STAT1, ни с STAT2 (рис. 3C, полосы 3 и 4 ), но оказала сильное влияние на ассоциацию BRCA1 и STAT1 с STAT1 и Промоторы STAT2 (фиг. 3C, дорожки 5-8 ). Каноническая передача сигналов IFN-γ включает связывание IFN-γ с его рецептором, что приводит к димеризации рецептора, активации активируемых Янусом киназ с последующим фосфорилированием и димеризацией STAT1 (27, 28).Эти гомодимеры STAT1 затем перемещаются в ядро, где они связываются и активируют транскрипцию генов, в первую очередь тех, которые содержат элементы гамма-активированной последовательности (GAS) в своих промоторах (27, 28). Поскольку мы показали, что STAT1 также присутствует на этих промоторах, мы предположили, что BRCA1 может связываться с этими промоторами STAT1-зависимым образом. Таким образом, возможно, что роль BRCA1 может заключаться в облегчении оптимального связывания гомодимеров STAT1 для дальнейшей индукции аппарата транскрипции IFN после обработки IFN-γ.

BRCA1 требуется для повышающей регуляции STAT1 и STAT2 в ответ на IFN-γ. A и B. Вестерн-блоты, показывающие отмену IFN-γ положительной регуляции STAT1 ( A ) и STAT2 ( B ) в клетках T47D с помощью миРНК BRCA1. Клетки T47D предварительно обрабатывали либо скремблированной миРНК, либо миРНК BRCA1 и 100 ед. / Мл IFN-γ в течение 24 часов. Затем мембраны вестерн-блоттинга исследовали на наличие BRCA1 ( вверху, ), STAT1 ( A , средний ) или STAT2 ( B , средний ) и GAPDH в качестве контроля загрузки ( внизу ). C. Иммунопреципитационный анализ хроматина, оценивающий рекрутирование полимеразы II ( Pol II ), BRCA1 и STAT1 на промоторы STAT1 и STAT2 в клетках T47D, оставленных необработанными ( C ) или обработанными 100 ед. / Мл IFN- γ ( γ ) в течение 12 ч. Два процента общей введенной ДНК использовали в качестве контроля загрузки ( Input ), а соответствующий изотипу иммуноглобулин G ( IgG ) использовали в качестве внутреннего контроля загрузки для иммунопреципитации. Затем был проведен ПЦР-анализ с использованием праймеров, специфичных для промоторов STAT1 и STAT2.

BRCA1 и IFN-γ взаимодействуют, чтобы индуцировать компоненты сигнального пути IFN типа I

Мы хотели определить механизм, посредством которого BRCA1 и IFN-γ взаимодействуют, чтобы регулировать синергетическую индукцию генов, таких как IRF-7 . Тот факт, что промотор IRF-7 не содержит элемента GAS, но действительно содержит элемент ответа, стимулированного IFN (ISRE), позволяет предположить, что это комплекс тримерного IFN-стимулированного гена фактора 3 (ISGF3), а не гомодимерные комплексы STAT1, которые опосредуют индукция ИРФ-7 (29).Действительно, элементы ISRE, а не элементы GAS, были обнаружены в промоторах генных мишеней, индуцированных BRCA1 / IFN-γ, идентифицированных в нашей предыдущей работе (25). Комплекс ISGF3, состоящий из STAT1, STAT2 и IRF-9, обычно индуцируется сигнальным путем IFN типа I. Этот путь редко индуцируется в ответ на передачу сигналов IFN-γ, что позволяет предположить, что индукция IRF-7 с помощью BRCA1 и IFN-γ может происходить через косвенный механизм.

Чтобы исследовать эту теорию, мы хотели определить, ассоциируется ли BRCA1 с промотором IRF-7 и, следовательно, регулирует ли его транскрипцию напрямую.Повторные анализы иммунопреципитации хроматина показали, что BRCA1 не может быть обнаружен на промоторе IRF-7 в клетках T47D даже после обработки IFN-γ (фиг. 4A, полосы 5 и 6 ). Однако STAT1 был обнаружен на промоторе IRF-7 IFN-γ-зависимым образом (фиг. 4A, дорожка 8, ), подразумевая, что STAT1-содержащий комплекс участвует в индукции IRF-7. Поскольку промотор IRF-7 содержит элемент ISRE, более вероятно, что его транскрипция может быть индуцирована IFN типа I, IFN-α и IFN-β (30).Поэтому мы хотели исследовать возможность того, что BRCA1 и IFN-γ могут взаимодействовать, чтобы индуцировать этот сигнальный путь типа I.

BRCA1 непосредственно связывается и регулирует промоторы IFN-α и IFN-β, но не промотор IRF-7 в ответ на IFN-γ. A. Иммунопреципитационный анализ хроматина, оценивающий рекрутирование РНК-полимеразы II, BRCA1 и STAT1 на промотор IRF-7 в клетках T47D, которые либо не обрабатывали, либо обрабатывали 100 ед. / Мл IFN-γ в течение 12 часов.Два процента общей введенной ДНК использовали в качестве контроля загрузки, а соответствующий изотипу иммуноглобулин G использовали в качестве внутреннего контроля загрузки для иммунопреципитации. Затем был проведен ПЦР-анализ с использованием праймеров, специфичных для промотора IRF-7. B. Иммунопреципитационный анализ хроматина, оценивающий привлечение полимеразы II, BRCA1 и STAT1 к промоторам IFN-α и IFN-β в клетках T47D, которые либо не обрабатывали, либо обрабатывали 100 ед. / Мл IFN-γ в течение 12 часов. Два процента общей введенной ДНК использовали в качестве контроля загрузки, а соответствующий изотипу иммуноглобулин G использовали в качестве внутреннего контроля загрузки для иммунопреципитации.Затем был проведен ПЦР-анализ с использованием праймеров, специфичных для промоторов IFN-α и IFN-β. C и D. Анализ ПЦР с обратной транскрипцией , показывающий индукцию IFN-α ( C ) и IFN-β ( D ) BRCA1 и IFN-γ. Клетки MBR62-bcl2, выращенные в присутствии или в отсутствие тетрациклина и оставленные без обработки или обработанные 100 ед. / Мл IFN-γ в течение 24 часов. РНК экстрагировали, подвергали обратной транскрипции и проводили ПЦР-амплификацию с использованием специфических праймеров к кДНК IFN-α или IFN-β.Изображения гелей были сохранены в виде файлов TIF, и была проведена денситометрия для количественного определения уровней экспрессии. Значения денситометрии отображаются под каждым изображением и выражаются относительно необработанного контрольного значения + tet. E. ELISA-анализ супернатанта, взятого из BRCA1-индуцибельных клеток MBR62-bcl2, показал, что BRCA1 и IFN-γ стимулируют высвобождение IFN типа I. Клетки MBR62-bcl2, выращенные в присутствии или в отсутствие тетрациклина и оставленные без обработки или обработанные 100 ед. / Мл IFN-γ в течение 24 часов. Результаты были получены из трех независимых экспериментов. F. Люциферазный анализ, показывающий, что активация конструкции промотора ISRE IFN-γ зависит от BRCA1. Клетки 293T обрабатывали скремблированной ( SCR ) или BRCA1 ( BRsi ) миРНК перед котрансфекцией либо пустой базовой конструкции pGL3, либо базовой конструкции pGL3, содержащей элемент ISRE (pGL3-ISRE) вместе с конструкцией цитомегаловирус-Renilla. Затем клетки либо оставляли необработанными, либо обрабатывали 1000 ед. / Мл IFN-γ в течение 6 часов перед анализом активности люциферазы Firefly или Renilla.Затем значения активности люциферазы светлячков выражали относительно активности люциферазы Renilla (которая служила контролем трансфекции).

Ранее было показано, что BRCA1 может взаимодействовать с STAT1 (17), предлагая модель, в которой стимуляция IFN-γ индуцирует транслокацию гомодимеров STAT1 в ядро, облегчая связывание с BRCA1. Этот комплекс затем может связываться с элементами GAS генов, таких как IFN-α и IFN-β , что приводит к их транскрипции.Чтобы показать, что BRCA1 и STAT1 могут взаимодействовать с этими промоторами в ответ на обработку IFN-γ, мы снова провели анализ иммунопреципитации хроматина в клетках T47D. Мы могли показать, что в ответ на IFN-γ BRCA1 имеет более сильную ассоциацию с промоторами IFN-α и IFN-β в клетках T47D (рис. 4B, полосы 5 и 6 ). Как и ожидалось для передачи сигналов типа I, STAT1 также локализован в промоторах IFN-α и IFN-β (фиг. 4B, полосы 7 и 8 ). Интересно отметить дифференциальное связывание STAT1 с промоторами IFN-α и IFN-β.STAT1 связывается с промотором IFN-α только в ответ на обработку IFN-γ, тогда как STAT1 связывается с промотором IFN-β независимо от стимуляции IFN-γ. Это дифференциальное наблюдение может быть связано с тем, что индукция IFN-α больше зависит от передачи сигналов STAT1 и, следовательно, требует более высокой степени регуляции. Наблюдение, что как BRCA1, так и STAT1 связаны с промоторами IFN-α и IFN-β, согласуется с количественными данными ПЦР с обратной транскрипцией, показывающими синергетическую индукцию как IFN-α, так и IFN-β после индуцибельной экспрессии BRCA1 в присутствии IFN-γ (рис.4C и D соответственно). Эта синергическая индукция IFN типа I была определена денситометрией как более 5-кратная в обоих случаях (по сравнению с необработанными, неиндуцированными контрольными клетками). Чтобы дополнительно продемонстрировать повышающую регуляцию передачи сигналов IFN типа I BRCA1- и IFN-γ-зависимым образом, мы провели тест ELISA на среде из клеток MBR62-bcl2 после обработки IFN-γ (рис. 4E). Очень низкие уровни IFN затрудняли количественную оценку с использованием нашего набора для анализа. Однако мы могли четко наблюдать последовательную активацию IFN-α в культуральной среде после индукции BRCA1 и после обработки IFN-γ.Это согласуется с нашими анализами иммунопреципитации хроматина и обратной транскрипции-ПЦР и предполагает участие IFN типа I в индукции генов-мишеней BRCA1 / IFN-γ и, следовательно, в апоптозе. Как следствие повышающей регуляции множества компонентов пути IFN типа I, можно предположить, что BRCA1 синергетически активирует промоторы ISRE-содержащих генов с IFN-γ. Чтобы показать это, мы использовали миРНК BRCA1 с последующей трансфекцией конструкций GAS-люциферазы или ISRE-люциферазы в высокотрансфицируемую клеточную линию 293T.Конструкции как GAS-люциферазы (данные не показаны), так и ISRE-люциферазы показали зависимость от BRCA1, но, в соответствии с предложенным нами механизмом, явно наблюдалась синергическая BRCA1-зависимая активация конструкции люциферазы pGL3-ISRE в клетках 293T после IFN-γ. лечение (рис. 4F). Почти полное прекращение активности ISRE-люциферазы в ответ на IFN-γ после нокдауна BRCA1 siRNA показало четкую зависимость для BRCA1 в этом процессе.

BRCA1- и IFN-γ — опосредованная индукция IRF-7 и ингибирование роста зависит от передачи сигналов IFN-α и IFN-β

Далее мы хотели выяснить, требуется ли наблюдаемая индукция IFN-α и IFN-β для синергической индукции IRF-7 BRCA1 и IFN-γ посредством предложенного непрямого механизма.Для этого мы использовали нейтрализующие антитела для ингибирования передачи сигналов IFN-α или IFN-β. Сначала мы оценили специфичность антисыворотки и соответствующих контролей в ответ на лечение IFN-α и IFN-β напрямую. Нозерн-блоттинг клеток T47D показал способность специфической антисыворотки к IFN-α и IFN-β блокировать опосредованную IFN-α и IFN-β индукцию IRF-7 (рис. 5A). ). Затем мы исследовали способность нейтрализующих антисывороток IFN-α и IFN-β ингибировать индукцию IRF-7 под действием IFN-γ.Нозерн-блоттинг показал, что ингибирование передачи сигналов IFN-α и IFN-β, по отдельности или в комбинации, могло отменить индукцию IRF-7 IFN-γ, тогда как контрольная антисыворотка не имела эффекта (фиг. 5B). Чтобы оценить влияние антисывороток к IFN-α и IFN-β на BRCA1 / IFN-γ-опосредованную индукцию IRF-7, мы провели аналогичные исследования на BRCA1-индуцибельных клетках MBR62-bcl2. Нозерн-блоттинг подтвердил синергетическую индукцию IRF-7 под действием BRCA1 в присутствии IFN-γ (фиг. 5C, полоса 4 , полоса ).Однако предварительная обработка клеток MBR62-bcl2 антисыворотками к IFN-α и IFN-β либо по отдельности (полосы 6, и 10 ), либо в комбинации (дорожка 14 ) отменила индукцию, опосредованную BRCA1 / IFN-γ. ИРФ-7. Эти данные поэтому предполагают, что передача сигналов IFN-α и IFN-β необходима для BRCA1 / IFN-γ-опосредованной индукции IRF-7.

Передача сигналов IFN-α и IFN-β необходима для индукции IRF-7 и подавления роста BRCA1 и IFN-γ. A. Нозерн-блот-анализ, показывающий ингибирование IRF-7, индуцированного IFN-7 типа, специфическими нейтрализующими антисыворотками. Клетки T47D предварительно обрабатывали антисывороткой IFN-α ( αAS ), контрольной антисывороткой IFN-α ( αC ), антисывороткой IFN-β ( βAS ) или контрольной антисывороткой IFN-β ( βC ) в течение 2 часов. . Затем клетки оставляли необработанными или обрабатывали либо 100 ед. / Мл IFN-α ( α ), либо 100 ед. / Мл IFN-β ( β ) в течение 24 часов. Полученную мембрану Нозерн-блоттинга гибридизовали с зондами кДНК для IRF-7 (, первая строка, ) и GAPDH в качестве контроля загрузки (, вторая строка, ).Значения под блотами указывают на интенсивность сигнала IRF-7 из трех повторных экспериментов, определенную денситометрическим анализом. B. Нозерн-блот-анализ, показывающий потребность в передаче сигналов IFN типа I при индукции IRF-7 с помощью IFN-γ. Клетки T47D предварительно обрабатывали антисывороткой IFN-α, контрольной антисывороткой IFN-α, антисывороткой IFN-β, контрольной антисывороткой IFN-β, комбинацией антисывороток IFN-α и IFN-β ( αβAS ) или комбинацией IFN- α и IFN-β контрольные антисыворотки ( αβC ) в течение 2 часов.Затем клетки оставляли без обработки или обрабатывали 100 ед. / Мл IFN-γ в течение 24 часов. Нозерн-блоты гибридизовали с зондами кДНК для IRF-7 (, первая строка, ) и GAPDH в качестве контроля загрузки (, вторая строка, ). Значения под блотами указывают на интенсивность сигнала IRF-7 из трех повторных экспериментов, определенную денситометрическим анализом. C. Нозерн-блот-анализ, показывающий потребность в передаче сигналов IFN типа I при синергической индукции IRF-7 BRCA1 и IFN-γ.Клетки MBR62-bcl2 выращивали в присутствии или в отсутствие тетрациклина и оставляли без обработки или обрабатывали 100 ед. / Мл IFN-γ в течение 24 часов. Клетки предварительно обрабатывали антисывороткой IFN-α, контрольной антисывороткой IFN-α, антисывороткой IFN-β, контрольной антисывороткой IFN-β, комбинацией антисывороток IFN-α и IFN-β или комбинацией контрольных IFN-α и IFN-β. антисыворотка. Нозерн-блоты гибридизовали с зондами кДНК для IRF-7 (, первая строка, ) и GAPDH в качестве контроля загрузки (, вторая строка, ). Значения под блотами указывают на интенсивность сигнала IRF-7 из трех повторных экспериментов, определенную денситометрическим анализом. D. Анализы подсчета колоний, показывающие потребность в передаче сигналов IFN типа I для подавления роста, опосредованного BRCA1 / IFN-γ. Клетки MBR62-bcl2 выращивали в присутствии или в отсутствие тетрациклина и обрабатывали 100 ед. / Мл IFN-γ. Клетки оставляли необработанными ( Mock ) или предварительно обрабатывали либо комбинацией антисывороток IFN-α и IFN-β, либо контрольными антисыворотками IFN-α и IFN-β. Клетки выращивали в течение ~ 5 дней, а затем фиксировали и окрашивали кристаллическим фиолетовым. E. Пятно кристаллического фиолетового затем реабсорбировалось и измерялось спектрофотометрическим анализом при 450 нм и выражалось в процентах от -tetγ (**, P <0.05 по сравнению с −tetγ).

Ранее мы показали, что индукция BRCA1 в присутствии IFN-γ вызывает синергетическое снижение пролиферации клеток из-за апоптоза (25). Поэтому мы хотели исследовать, какое влияние ингибирование сигнальных путей IFN-α и IFN-β будет иметь на этот антипролиферативный фенотип. Используя анализ количества колоний в BRCA1-индуцибельных клетках MBR62-bcl2, мы наблюдали, что снижение пролиферации клеток, опосредованное BRCA1 и IFN-γ, серьезно нарушалось нейтрализующими IFN антителами I типа (рис.5D). Когда BRCA1 индуцировали в присутствии IFN-γ, наблюдалось снижение пролиферации клеток примерно на 50% по сравнению с одним IFN-γ (фиг. 5E). Однако после предварительной обработки клеток комбинацией IFN-α и IFN-β антисыворотка снижала снижение пролиферации клеток до ~ 25%, статистически значимое наблюдение ( P = 0,0038). Предварительная обработка контрольной антисывороткой не влияла на опосредованное BRCA1 / IFN-γ снижение пролиферации клеток (фиг. 5E), что свидетельствует о специфичности передачи сигналов IFN-α и IFN-β в этом процессе.

Discussion

В текущем исследовании мы предлагаем механизм, посредством которого BRCA1 регулирует IFN-γ-зависимую передачу сигналов. Мы используем экспрессию IRF-7, гена, который, как известно, синергетически регулируется как BRCA1, так и IFN-γ, в качестве репортера транскрипционного выхода этого пути. Мы показываем, что IRF-7 синергетически активируется, когда BRCA1 индуцируется в присутствии IFN-γ, и, кроме того, что BRCA1 необходим для индукции IRF-7 с помощью IFN-γ. Мы предоставляем доказательства, чтобы показать, что индукция IRF-7 BRCA1 и IFN-γ зависит как от STAT1, так и от STAT2, и предлагаем модель, согласно которой BRCA1 и IFN-γ опосредуют индукцию IRF-7 через косвенный механизм, который зависит от IFN типа I. сигнализация.Мы показываем, что BRCA1 локализован в промоторах молекул, участвующих в передаче сигналов IFN типа I, что приводит к их положительной регуляции. Наконец, мы показываем, что передача сигналов типа I необходима для подавления роста, опосредованного BRCA1 / IFN-γ.

Наблюдения, сделанные в этом исследовании, дополнительно подчеркивают особую роль BRCA1 в модуляции пути передачи сигналов IFN-γ, связь, которая была впервые предложена Ouchi et al. (17), где было показано, что BRCA1 может связываться и модулировать транскрипционную активность STAT1, что позволяет предположить, что BRCA1 может играть уникальную роль в IFN-γ-зависимой системе наблюдения за опухолью.Концепция иммунного надзора или иммуноредактирования была впервые выдвинута в 1970-х годах (31), но только недавно IFN-γ был вовлечен в этот процесс (32-34). В предыдущих исследованиях было показано, что у мышей, лишенных чувствительности к IFN-γ, или мышей с дефицитом STAT1, опухоли развивались быстрее и с большей частотой, чем у мышей дикого типа, при заражении химическим канцерогеном. Было показано, что IFN-γ действует, по крайней мере частично, непосредственно на опухолевые клетки, что приводит к усилению иммуногенности опухолевых клеток (32).Также было показано, что у мышей с дефицитом как STAT1, так и RAG2 (критического гена, необходимого для функции лимфоцитов) спонтанные опухоли развиваются с большей скоростью, чем у мышей дикого типа. Интересно, что было показано, что большой процент опухолей, которые развивались у мышей, лишенных как STAT1, так и RAG2, были опухолями молочной железы (33). В соответствии с этими данными было показано, что у мышей STAT1 ^{— / —} спонтанно развились опухоли, большинство из которых также были опухолями груди (35). Эти наблюдения предполагают важную роль STAT1 и пути передачи сигналов IFN в предотвращении развития рака груди.

В то время как наш вывод о том, что STAT1 необходим для индукции IRF-7 с помощью IFN-γ, не является полностью неожиданным (поскольку он имеет решающее значение для передачи сигналов как IFN типа I, так и типа II), открытие, что STAT2 также необходим, является более интригующим, потому что STAT2 преимущественно участвует в передаче сигналов IFN типа I. Требование как STAT1, так и STAT2 для индукции IRF-7 подразумевает образование комплекса ISGF3. Поскольку комплексы ISGF3 редко образуются в ответ на передачу сигналов IFN-γ, это повышает вероятность того, что либо ( a ) индукция BRCA1 в присутствии IFN-γ напрямую вызвала образование комплекса ISGF3, который мог бы стимулировать экспрессию IRF-7, или (b ), что BRCA1 и IFN-γ вместе стимулируют экспрессию IFN-α и / или IFN-β, действуя аутокринным образом, индуцируя экспрессию IRF-7.Наше наблюдение, что BRCA1 и IFN-γ опосредуют синергетическую индукцию IFN-α и IFN-β и что передача сигналов через этот путь необходима для BRCA1 / IFN-γ-опосредованной индукции IRF-7, указывает на последний сценарий. Это дополнительно подтверждается тем фактом, что в повторных экспериментах по иммунопреципитации хроматина мы не смогли обнаружить присутствие BRCA1, связанного с промотором IRF-7, но могли легко достичь этого с помощью многих промоторов, участвующих в передаче сигналов IFN типа I. В нашей модели мы предполагаем, что BRCA1 и IFN-γ вместе вызывают индукцию IFN типа I, которые секретируются и, в свою очередь, могут связываться с рецепторами на их клеточной поверхности аутокринным и паракринным образом.Это индуцирует образование и ядерную транслокацию комплексов факторов транскрипции ISGF3, которые могут нацеливаться на промоторы генов, таких как IRF-7 , и стимулировать их экспрессию. Это усиливается за счет активации компонентов ISGF3 (т.е. STAT1 и STAT2) IFN-γ. Мы идентифицировали ряд предполагаемых элементов GAS как в промоторах IFN-α, так и в IFN-β, предполагая, что это может быть механистической основой наших наблюдений. Однако существует также вероятность того, что повышающая регуляция BRCA1 IFN-α и IFN-β (и, вероятно, рецепторов IFN I типа) может включать дополнительный промежуточный этап через IRF-1, поскольку этот фактор транскрипции также содержит элемент GAS в своем промоторе. и, в свою очередь, было показано, что он активирует IFN типа I через положительные регуляторные домены в промоторах IFN-α и IFN-β (36).Независимо от тонкой настройки, мы считаем, что активация сигнальных компонентов комплексом BRCA1 / STAT1 может объяснить причину, по которой IRF-7 синергетически активируется только BRCA1 и IFN-γ, а не IFN-α или IFN. -β. Мы представили нашу механистическую модель этого процесса на рис. 6. . После связывания IFN-γ с его рецептором STAT1 фосфорилируется по Tyr ⁷⁰¹ (и оптимально Ser ⁷²⁷ ), что приводит к димеризации STAT1, его транслокации в ядро ​​и связыванию димеров STAT1 с промоторами генов, содержащих Элементы GAS, такие как STAT1, STAT2, IRF-9, IFN-α и IFN-β.Образующиеся в результате IFN-α и IFN-β секретируются из клеток и могут действовать аутокринным (и паракринным) образом, связываясь с рецептором IFN-α на той же клетке или соседних клетках. Димеризация рецептора IFN-α приводит к образованию комплекса ISGF3 (компоненты которого уже были активированы в первой половине сигнального пути), что приводит к усиленному образованию комплекса и связыванию промоторов, содержащих ISRE, что приводит к синергетическому эффекту. индукция таких генов, как IRF-7 .

Схематическое изображение предложенного механизма положительной обратной связи, участвующего в синергической индукции IRF-7 посредством BRCA1 и IFN-γ.

Возможность того, что IRF-7 может действовать как апоптотический регулятор, была ранее высказана на основании способности IRF-7 регулировать экспрессию генов, ранее участвовавших в контроле клеточного цикла и апоптоза (37). IRF-7 может играть роль супрессора опухолей сам по себе, поскольку было показано, что он подавляется гиперметилированием в ряде линий раковых клеток и опухолей (29, 38, 39) и важен для дифференцировки моноцитов (40 ).Также было высказано предположение, что IRF-7 может играть роль в регуляции путей стрессовой реакции и в поддержании стабильности генома, поскольку было обнаружено, что IRF-7 может быть активирован с помощью NH ₂ -концевого фосфорилирования после повреждения ДНК (41 ). IRF-7 может также играть роль в врожденном иммунитете и иммунном надзоре с помощью генов, активирующих транскрипцию, таких как RANTES, TAP2 и 2 ‘, 5’-олигоаденилатсинтаза ( 2′, 5′-OAS ; ссылки 42 , 43). Мы предполагаем, что IRF-7, который находится ниже передачи сигналов IFN типа I и II, представляет собой ключевой регулятор иммунного надзора и что BRCA1 контролирует его экспрессию благодаря своей способности модулировать транскрипционную активность STAT1.

Поэтому мы предлагаем усовершенствованную версию модели, первоначально предложенную Ouchi et al. (17), в которых мутация BRCA1 или потеря функции BRCA1 приведет к снижению индукции целевых генов IFN-γ, таких как IRF-7 , и, следовательно, к снижению способности IFN-γ подавлять рост опухолевых клеток. Мы предполагаем, что, когда опухолевые клетки дикого типа BRCA1 опрашиваются иммунной системой и стимулируются IFN-γ (как следствие секреции Т-клетками или естественными клетками-киллерами в микроокружении опухоли), BRCA1 и STAT1 действуют согласованно, повышая — регулируют подмножество генов-мишеней, таких как IRF-7, MxA, TAP1, 2 ‘, 5’-OAS и ISG54 .Повышение регуляции этих генов приводит к усилению иммунного ответа за счет увеличения презентации антигена, увеличения высвобождения хемокинов и, в конечном итоге, к апоптотической гибели клеток. Это приведет к уничтожению опухолевой клетки. Однако, если опухолевая клетка является мутантом BRCA1 или функция BRCA1 нарушена, стимуляция IFN-γ не приведет к усилению регуляции этих генов, и опухолевая клетка может уклониться от этого первоначального противоопухолевого действия IFN-γ. Эта модель подтверждается гистопатологическими особенностями опухолей, мутантных по BRCA1, которые характеризуются высокой инфильтрацией лимфоцитов.Это означает неорганизованную секрецию хемокинов в микроокружении опухолей с дефицитом BRCA1. Следовательно, в дополнение к предполагаемой роли BRCA1 в качестве супрессора опухолей, связанной с его репарацией повреждений ДНК и действиями по контролю клеточного цикла, мы предполагаем, что он также функционирует как важный медиатор иммунного надзора и врожденного иммунитета. Мы считаем, что представленные здесь данные дают новое представление о механизме, лежащем в основе способности BRCA1 действовать как ген-супрессор опухоли, и о том, как потеря функции BRCA1 может привести к развитию опухоли.

Материалы и методы

Создание и поддержание клеточных линий

Клетки MBR62-bcl2 были созданы и поддерживались, как описано ранее (25). Клеточная линия рака молочной железы T47D поддерживалась в RPMI с добавлением 10% FCS, 1 ммоль / л пирувата натрия, 50 мкг / мл пенициллин-стрептомицина и 2 ммоль / л l-глутамина (все от Life Technologies, Inc., Пейсли, США). Объединенное Королевство). Все клетки выращивали в 5% CO ₂ в увлажненном инкубаторе.

Нозерн-блот-анализ

выделяли из клеток с использованием реагента для выделения общей РНК RNA STAT-60 (Tel-Test, Inc., Френдсвуд, Техас). Двадцать микрограммов РНК разделяли на 1% формальдегидном геле, переносили на мембрану Hybond-N (Amersham Biosciences, Amersham, Buckinghamshire, Великобритания) и зондировали радиоактивно меченной кДНК, проверенной на IRF-7 человека (IMAGE Clone 1628700) и глицеральдегид-альдегид. 3-фосфатдегидрогеназа [GAPDH; генерируется, как описано ранее (25)].

Вестерн-блоттинг и антитела

Лизаты белков экстрагировали в буфере для лизиса ЭДТА (0,25 моль / л NaCl, 0,1% IEPGAL, 0.25 моль / л HEPES, 5 ммоль / л EDTA, 0,5 ммоль / л DTT), разделенные на SDS-полиакриламидном геле и перенесенные на поливинилидендифторидную мембрану с последующим иммуноблоттингом. Антитела против STAT1 и STAT2 были приобретены у Cell Signaling (Данверс, Массачусетс) и Santa Cruz Biotechnology (Санта-Крус, Калифорния), соответственно. Мышиные моноклональные анти-GAPDH (Biogenesis, Oxford, United Kingdom) использовали для демонстрации равной загрузки белка. BRCA1 подвергали иммунопреципитации с помощью Ab-1 и подвергали иммуноблоттингу с помощью Ab-4 (онкоген, Кембридж, Массачусетс).

Рекомбинантные человеческие IFN-α, IFN-β и IFN-γ использовали в количестве 100 единиц / мл, если не указано иное (все закуплены у Calbiochem, Nottingham, United Kingdom).

Антисыворотка к человеческому IFN-α (G-026-501-568) и IFN-β (G-028-501-568) и их соответствующие контроли (G-027-501-568 и G-029-501-568 ) были использованы в анализах нейтрализации (Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний, Bethesda, MD).

IFN-α ELISA проводили в соответствии с инструкциями производителя (PBL Biomedical Laboratories, Piscataway, CA).

Анализы иммунопреципитации хроматина

Анализы иммунопреципитации хроматина проводили, как описано Kennedy et al. (44) с использованием следующих праймеров для ПЦР-амплификации соответствующих промоторов: IRF-7 S, 5′-GCTACAAGCCCTCAGTCCAC-3 ‘; IRF-7 AS, 5’-TTACCTCTCAGGAGCCAAGG-3 ‘; STAT1 S, 5’-TCTCGGCGATGAAACTACATCA-3 ‘; STAT1 AS, 5’-GGGAACTGGCGTTCTCTTTA-3 ‘; STAT2 S, 5’-ACTTCTCCACCAATCGCTGA-3 ‘; STAT2 AS, 5’-CGCCTACAACTTCGGCTAAC-3 ‘; IFN-α S, 5’-GGAACAAGATGGGGAAGACA-3 ‘; IFN-α AS, 5’-CCTGCAAATGCCTTAAATAGG-3 ‘; IFN-β S, 5’-TCGTTTGCTTTCCTTTGCTT-3 ‘; IFN-β AS, 5’-CCCACTTTCACTTCTCCCTTT-3 ‘.

IFN-α и IFN-β ПЦР с обратной транскрипцией

РНК собирали из клеток рака молочной железы MBR62-bcl2 и подвергали обратной транскрипции с использованием обратной транскриптазы вируса мышиного лейкоза Молони (Invitrogen, Paisley, United Kingdom). ПЦР использовали для обнаружения IFN-α и IFN-β с использованием следующих праймеров: IFN-α S, 5′-TGATGGCAACCAGTTCCAGAAGGCTCAAG-3 ‘; IFN-α AS, 5’-ACAACCTCCCAGGCACAAGGGCTGTATTT-3 ‘; IFN-β S, 5’-CACGACAGCTCTTTCCATGA-3 ‘; IFN-β AS, 5’-AGCCAGTGCTCGATGAATCT-3 ‘. ПЦР-амплификацию GAPDH проводили с использованием следующих праймеров: GAPDH F, 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ‘; GAPDH R, 5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 ‘.

Эксперименты с SiRNA

Клетки трансфицировали в течение 2 дней подряд либо специфической миРНК к целевому гену, либо скремблированным контролем, используя протокол на основе олигофектамина (Invitrogen). Через 48 часов после второй трансфекции клетки обрабатывали IFN-γ и собирали через 24 часа. BRCA1 SMARTpool, IRF-7, STAT1, STAT2 и скремблированные контрольные олигонуклеотиды siRNA были приобретены у Dharmacon DNA Technologies (Нортумберленд, Великобритания).

Эксперименты с люциферазой

Клетки 293T почек эмбриона человека трансфицировали в последовательные дни с помощью скремблированного контроля или BRCA1-специфических олигонуклеотидов siRNA (как подробно описано выше).На следующий день клетки разделяли на шестилуночные чашки и оставляли для прилипания в течение 6 часов. Затем их трансфицировали базовым пустым вектором pGL3 (0,5 мкг / лунку), конструкциями люциферазы pGL3-GAS или pGL3-ISRE и котрансфицировали 0,1 мкг / лунку люциферазой цитомегаловируса-Renilla с использованием реагента для трансфекции GeneJuice (Novagen, Ноттингем, Великобритания) в соответствии с инструкциями производителя. инструкции. Спустя шестнадцать часов добавляли 1000 единиц / мл человеческого IFN-γ и оставляли на 6 часов. Клетки промывали PBS, лизировали в течение 20 мин в буфере для пассивного лизиса 1 × (Promega) и анализировали на активность люциферазы светлячка и Renilla с использованием растворов для анализа d-люциферина и целентеразина соответственно.

Благодарности

Мы благодарим Гейл Стюарт за ее техническую помощь, доктора Кейт Фицджеральд за ее помощь и советы и профессора Алана Эшворта (директора Исследовательского центра прорыва, Лондон, Великобритания) за любезный подарок pGL3- Люциферазные конструкции GAS и pGL3-ISRE.

Сноски

• Грантовая поддержка: European Social Fund (N.E. Buckley), Cancer Research UK, грант C538 / A4362 (P.B. Mullan, J.J. Gorski, J.M. Mulligan, and D.П. Харкин), R&D Office Northern Ireland (J.W. Purcell) и Action Cancer (A.M. Hosey).

• Расходы на публикацию этой статьи были частично покрыты за счет оплаты страницы. Таким образом, данная статья должна быть помечена как реклама в соответствии с 18 U.S.C. Раздел 1734 исключительно для указания этого факта.

• • Принято 9 января 2007 г.
  • Получено 9 августа 2006 г.
  • Исправление получено 20 ноября 2006 г.
• Американская ассоциация исследований рака

Ссылки

1. ↵

   Miki Y, Swensen J, Shattuck-Eidens D, et al. Сильный кандидат на ген восприимчивости к раку груди и яичников BRCA1. Science 1994; 266: 66–71.

2. ↵

   Antoniou A, Pharoah PD, Narod S, et al. Средние риски рака груди и яичников, связанные с мутациями BRCA1 или BRCA2, обнаруженными в серии случаев, не выбранных для семейного анамнеза: комбинированный анализ 22 исследований.Am J Hum Genet 2003; 72: 1117–30.

3. ↵

   Фитцджеральд М.Г., Макдональд Д.Д., Крайнер М. и др. Мутации BRCA1 зародышевой линии у еврейских и нееврейских женщин с ранним началом рака груди. N Engl J Med 1996; 334: 143–9.

4. ↵

   Ян К., Сакураи Т., Мори И. и др. Прогностическое значение экспрессии BRCA1 в японских спорадических карциномах молочной железы. Рак 2001; 92: 54–60.

5. ↵

   Venkitaraman AR. Функции BRCA1 и BRCA2 в биологическом ответе на повреждение ДНК.J Cell Sci 2001; 114: 3591–8.

6. ↵

   Монтейро А.Н., Август А., Ханафуса Х. Доказательства функции транскрипционной активации С-концевой области BRCA1. Proc Natl Acad Sci U S. A 1996; 93: 13595–9.

7. Чепмен М.С., Верма И.М. Активация транскрипции BRCA1. Nature 1996; 382: 678–9.

8. ↵

   Бернабеи П., Бостикардо М., Лосана Г. и др. IGF-1 подавляет экспрессию на поверхности цепи IFN-γ R2 и снижает чувствительность передачи сигналов IFN-γ / STAT-1 в Т-лимфоцитах человека.Кровь 2003; 102: 2933–9.

9. ↵

   Monteiro AN. BRCA1: изучение ссылок на транскрипцию. Trends Biochem Sci 2000; 25: 469–74.

10. ↵

    переулок TF. BRCA1 и транскрипция. Cancer Biol Ther 2004; 3: 528–33.

11. ↵

    Харкин Д.П., Бин Дж. М., Миклос Д. и др. Индукция GADD45 и JNK / SAPK-зависимого апоптоза после индуцибельной экспрессии BRCA1. Cell 1999; 97: 575–86.

12. ↵

    MacLachlan TK, Somasundaram K, Sgagias M, et al.Эффекты BRCA1 на клеточный цикл и ответ на повреждение ДНК связаны с измененной экспрессией генов. Журнал биологии химии, 2000; 275: 2777–85.

13. ↵

    Somasundaram K, Zhang H, Zeng YX, et al. Для остановки клеточного цикла опухолевым супрессором BRCA1 требуется ингибитор CDK p21WAF1 / CiP1. Nature 1997; 389: 187–90.

14. ↵

    Kawai H, Li H, Chun P, Avraham S, Avraham HK. Прямое взаимодействие между BRCA1 и рецептором эстрогена регулирует транскрипцию и секрецию фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в клетках рака молочной железы.Онкоген 2002; 21: 7730–9.

15. ↵

    Fan S, Ma YX, Wang C и др. Роль прямого взаимодействия BRCA1 в ингибировании активности рецепторов эстрогена. Онкоген 2001; 20: 77–87.

16. ↵

    Zhang H, Somasundaram K, Peng Y, et al. BRCA1 физически связывается с p53 и стимулирует его транскрипционную активность. Онкоген 1998; 16: 1713–21.

17. ↵

    Оучи Т., Ли С.В., Оучи М., Ааронсон С.А., Хорват СМ. Взаимодействие преобразователя сигнала и активатора транскрипции 1 (STAT1) и BRCA1 в дифференциальной регуляции генов-мишеней IFN-γ.Proc Natl Acad Sci U S. A 2000; 97: 5208–13.

18. Ван Кью, Чжан Х, Кадзино К., Грин Мичиган. BRCA1 связывает c-Myc и ингибирует его транскрипционную и трансформирующую активность в клетках. Онкоген 1998; 17: 1939–48.

19. Yu X, Wu LC, Bowcock AM, Aronheim A, Baer R. С-концевые (BRCT) домены BRCA1 взаимодействуют in vivo с CtIP, белком, участвующим в пути CtBP репрессии транскрипции. J Biol Chem 1998; 273: 25388–92.

20. ↵

    Пао Г.М., Янкнехт Р., Раффнер Х., Хантер Т., Верма И.М. CBP / p300 взаимодействует с коактиваторами транскрипции BRCA1 и функционирует в качестве коактиваторов. Proc Natl Acad Sci U S. A 2000; 97: 1020–5.

21. ↵

    Chiba N, Parvin JD. Связь BRCA1 и BARD1 с холоферментом РНК-полимеразы II. Cancer Res 2002; 62: 4222–8.

22. ↵

    Андерсон С.Ф., Шлегель Б.П., Накадзима Т., Вулпин Е.С., Парвин Дж.Д. Белок BRCA1 связан с холоферментным комплексом РНК-полимеразы II через РНК-геликазу А.Нат Генет 1998; 19: 254–6.

23. ↵

    Yarden RI, Brody LC. BRCA1 взаимодействует с компонентами гистондеацетилазного комплекса. Proc Natl Acad Sci U S. A 1999; 96: 4983–8.

24. ↵

    Бочар Д.А., Ван Л., Бения Х и др. BRCA1 связан с человеческим комплексом SWI / SNF: связывая ремоделирование хроматина с раком груди. Cell 2000; 102: 257–65.

25. ↵

    Andrews HN, Mullan PB, McWilliams S, et al. BRCA1 регулирует апоптотический ответ, опосредованный интерфероном γ.J Biol Chem 2002; 277: 26225–32.

26. ↵

    Wong LH, Hatzinisiriou I, Devenish RJ, Ralph SJ. Примирование IFN-γ активирует компоненты фактора 3 гена, стимулированного IFN (ISGF3), увеличивая чувствительность IFN-устойчивых клеток меланомы к IFN типа I. J Immunol 1998; 160: 5475–84.

27. ↵

    Дарнелл Дж. Э. младший, Керр И. М., Старк Г. Р.. Пути Jak-STAT и активация транскрипции в ответ на IFN и другие внеклеточные сигнальные белки. Наука 1994; 264: 1415–21.

28. ↵

    Darnell JE, Jr. Исследования IFN-индуцированной активации транскрипции раскрывают путь Jak-Stat. J. Interferon Cytokine Res 1998; 18: 549–54.

29. ↵

    Lu R, Au WC, Yeow WS, Hageman N, Pitha PM. Регуляция промоторной активности гена фактора регуляции интерферона-7. Активация интерфероном и подавление гиперметилирования. J. Biol Chem. 2000; 275: 31805–12.

30. ↵

    Сато М., Хата Н., Асагири М., Накая Т., Танигучи Т., Танака Н.Положительная обратная связь регуляции генов IFN типа I с помощью IFN-индуцибельного фактора транскрипции IRF-7. FEBS Lett 1998; 441: 106–10.

31. ↵

    Бернет FM. Понятие об иммунологическом надзоре. Prog Exp Tumor Res 1970; 13: 1-27.

32. ↵

    Каплан Д.Х., Шанкаран В., Дигхе А.С. и др. Демонстрация интерферон-зависимой системы наблюдения за опухолью у иммунокомпетентных мышей. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1998; 95: 7556–61.

33. ↵

    Шанкаран В., Икеда Х., Брюс А.Т. и др.IFNγ и лимфоциты предотвращают развитие первичной опухоли и формируют иммуногенность опухоли. Природа 2001; 410: 1107–11.

34. ↵

    Ikeda H, Old LJ, Schreiber RD. Роль IFN-γ в защите от развития опухолей и иммуноредактировании рака. Фактор роста цитокинов Ред. 2002; 13: 95–109.

35. ↵

    Шрайбер Д. Докладчик 041: Stat1 и иммуноредактирование рака. Jaks and Stats: развитие болезни. Симпозиумы Keystone. 2004.

36. ↵

    Мацуяма Т., Кимура Т., Китагава М. и др.Направленное нарушение IRF-1 или IRF-2 приводит к аномальной индукции гена IFN типа I и аберрантному развитию лимфоцитов. Cell 1993; 75: 83–97.

37. ↵

    Barnes BJ, Richards J, Mancl ME, Hanash S, Beretta L, Pitha PM. Глобальные и специфические мишени IRF-5 и IRF-7 во время врожденного ответа на вирусную инфекцию. Дж. Биол. Хим. 2004; 279: 45194–207.

38. ↵

    Yu J, Ni M, Xu J, et al. Профилирование метилирования двадцати промотор-CpG-островков генов, которые могут вносить вклад в гепатоцеллюлярный канцерогенез.BMC Рак 2002; 2: 29.

39. ↵

    Yu J, Zhang H, Gu J и др. Профили метилирования тридцати четырех островков промотор-CpG и согласованное поведение метилирования шестнадцати генов, которые могут вносить вклад в канцерогенез астроцитомы. BMC Cancer 2004; 4:65.

40. ↵

    Lu R, Pitha PM. Дифференцировка моноцитов в макрофаги требует фактора регуляции интерферона 7. J Biol Chem 2001; 276: 45491-6.

41. ↵

    Kim TK, Kim T., Kim TY, Lee WG, Yim J.Химиотерапевтические препараты, повреждающие ДНК, активируют регуляторный фактор-7 интерферона с помощью митоген-активируемой протеинкиназы киназы-4-c-Jun NH ₂ -концевого киназного пути. Cancer Res 2000; 60: 1153–6.

42. ↵

    Слуга MJ, Tenoever B, Lin R. Перекрывающиеся и отдельные механизмы, регулирующие функцию IRF-3 и IRF-7. J Interferon Cytokine Res 2002; 22: 49–58.

43. ↵

    Чжан Л., Pagano JS. Фактор регуляции интерферона 7 опосредует активацию Tap-2 латентным мембранным белком 1 вируса Эпштейна-Барра.Дж. Вирол 2001; 75: 341–50.

44. ↵

    Kennedy RD, Gorski JJ, Quinn JE, et al. BRCA1 и c-Myc связываются для транскрипционной репрессии псориазина, гена, индуцирующего повреждение ДНК. Cancer Res 2005; 65: 10265–72.

IFN Academy

IFNA ™ ОНЛАЙН-ОБУЧЕНИЕ

Q — Кто может записаться на программы онлайн-обучения IFNA ™?

A — Любой старше 18 лет имеет право пройти обучение по IFNA ™ ! Следующие варианты доступны для удовлетворения ваших потребностей:

• Непрерывное профессиональное образование (CPEU)
• Свидетельство об обучении (СОТ)
• Сертификат продвинутой практики, сертифицированный специалист по интегративным и функциональным вопросам, IFNCP ™

Q — Могу ли я поступить на курс IFNA ™ Tracks в удобном для меня темпе? Как долго у меня будет доступ к трекам?

A — Вы можете прогрессировать в своем собственном темпе, однако есть 24-месячные временные рамки для завершения требуемых Треков, как указано ниже:

• Свидетельство об обучении (СОТ): треки 1-4
• Сертифицированный специалист по комплексному и функциональному питанию (IFNCP ™): треки 1-5

Срок в 24 месяца основан на дате вашей первоначальной регистрации трека в IFNA.По истечении этого срока студенты исключаются из программы обучения IFNA.

Для получения дополнительной информации о сертификате IFNCP ™ Advanced Practice Credential, включая требования к экзамену совета директоров, посетите IFNCP ™ Credential Q&A Handbook

Q — Сколько времени я могу ожидать, чтобы завершить каждый модуль?

A — По нашим оценкам, вам потребуется около 7 часов для завершения каждого модуля, однако это будет зависеть от того, сколько раз вы решите просмотреть материалы, включенные в каждый модуль.Мы предлагаем 33 «полностью загруженных» модуля, разделенных на 5 треков. Щелкните здесь для описания каждого модуля. Каждый модуль состоит из множества компонентов, включая 90-120-минутную видеопрезентацию, которую преподают специально приглашенные преподаватели, исчерпывающий инструментарий, множество ресурсов, включая раздаточные материалы, протоколы, фирменные документы, ресурсы, анкеты для пациентов, загружаемые электрические розетки и конечные материалы. модуль викторины.

РЕГИСТРАЦИЯ, ТАРИФЫ И СКИДКИ

Q — Есть ли определенные временные рамки, в которые мне нужно зарегистрироваться для треков IFNA ™, или я могу зарегистрироваться в любое время?

A — Вы можете зарегистрироваться на любой трек IFNA в любое время, однако мы рекомендуем начать с трека 1.Нажмите здесь, чтобы зарегистрироваться: https://www.ifnacademy.com/register-here/

Q — Предлагаются ли групповые скидки?

А — Да! IFNA ™ предлагает групповые скидки для 5 или более человек, зачисляемых по нашей программе. Пожалуйста, свяжитесь с нашим офисом для получения специальных скидок для вашей группы.

Q — Получают ли студенты скидки?

A — IFNA предлагает скидки только стажерам на очной форме и студентам бакалавриата.Все учащиеся должны предоставить подтверждение статуса очного обучения ПЕРЕД покупкой Дорожки 1. Скидки для студентов применяются ТОЛЬКО к Дорожке 1 и не могут суммироваться с 10% скидкой на членство. Пожалуйста, отправьте подтверждение постоянного статуса (т. Е. Текущие стенограммы) на адрес [email protected]. Пожалуйста, обратитесь к нашему тарифу для получения дополнительной информации.

Q — Предлагает ли IFNA какие-либо скидки для диетологов VA?

А — Да! Диетологи VA, заинтересованные в регистрации в программе IFNA, имеют право на получение 10% скидки на треки 1-5.Эта специальная скидка также может быть использована вместе с 10% скидкой на членство, которая также распространяется на треки 1-5. Свяжитесь с нами по адресу [email protected], чтобы запросить специальный код купона VA для использования во время регистрации. Благодарим вас за служение нашим ветеранам!

Q — Предлагает ли IFNA какие-либо скидки для военных и военнослужащих?

А — Да! Военнослужащие и военные, заинтересованные в регистрации в программе IFNA, имеют право на получение 10% скидки на треки 1-5.Эта специальная скидка также может быть использована вместе с 10% скидкой на членство, которая также распространяется на треки 1-5. Свяжитесь с нами по адресу [email protected], чтобы запросить специальный код военного купона для использования при регистрации. Благодарим вас за служение нашей стране!

Q — Разрешает ли IFNA ™ планы платежей или депозиты?

A — В настоящее время мы не предлагаем планы оплаты и не принимаем депозиты. Полная оплата производится при регистрации для каждого трека.

Q — Какова политика возврата средств IFNA ™?

A — После того, как вы зарегистрируетесь в любом из треков IFNA ™ или курса пересмотра IFNCP ™ , вы получите немедленный доступ, и, следовательно, возврат средств не допускается.

СВИДЕТЕЛЬСТВО ОБ ОБУЧЕНИИ (СОТ) в сравнении с УЧЕТНЫМИ ТРЕБОВАНИЯМИ IFNCP ™

Q — Какие требования предъявляются к Сертификату обучения IFNA ™ (COT)?

A — Чтобы получить сертификат обучения IFNA ™ , студенты должны успешно пройти треки 1, 2, 3 и 4, а также все тесты по модулю. Чтобы просмотреть описание каждого модуля в каждой дорожке, щелкните здесь.

Q — Кто имеет право подать заявку на получение удостоверения IFNCP ™?

A — Право на участие:

1. Практикующие врачи (т.е. Зарегистрированные диетологи-диетологи, дипломированные медсестры, практикующие медсестры и т. Д.)
2. Стажеры-диетологи
3. Студенты магистратуры или докторантуры в области здравоохранения / питания
4. Тренеры по здоровью, массажисты, личные тренеры и консультанты по питанию, имеющие как минимум степень бакалавра наук в области питания в аккредитованном университете

Те, кто проявляет большой интерес, но не имеют формального образования, не имеют права подавать заявление на получение сертификата IFNCP ™ .В случаях, когда право на участие не определено, аттестационная комиссия будет определять индивидуальный подход. Если у вас есть вопросы о праве на участие, свяжитесь с нами по адресу [email protected].

Q — Какие требования предъявляются к аттестату продвинутой практики IFNCP ™?

A — Претенденты должны:

• завершите все 5 треков в течение 24 месяцев (для получения описания каждого модуля в треках щелкните здесь). IFNA не разрешает пропуск или «тестирование» любых треков.
• пройти все тесты модулей
• подать заявку (по окончании всей программы)
• — сдать экзамен на квалификацию IFNCP ™

В. Позволяет ли мне сертификат IFNCP работать диетологом на законных основаниях?

A — Сертификат IFNCP не заменяет лицензию и не дает права называть себя «лицензированным» диетологом или диетологом. Тем не менее, получение сертификата IFNCP выделит вас как человека, сдавшего рецензируемый экзамен советом директоров и прошедшего повышение квалификации в области интегративного и функционального питания.Это, безусловно, откроет для вас множество дверей, однако вы несете ответственность за то, чтобы оставаться в рамках своей практики.

ЗАЧЕТЫ / КРЕДИТЫ ДЛЯ ПРОДОЛЖЕНИЯ ОБРАЗОВАНИЯ

Q — Предлагаются ли единицы непрерывного профессионального образования (CPEU) для RDN?

А — Да! В настоящее время CPEU предлагаются для всех модулей (по 7 на модуль) в каждом из 5 треков (за исключением модулей 6 и 8 в треке 2) и обзорного курса IFNCP ™ (2 CEU).Общее количество предлагаемых CPEU составляет 220. RDN в США, подающие заявки на CPEU с CDR, должны подавать заявку на каждый модуль отдельно. Тем не менее, для каждого трека будет вручен только один сертификат об окончании.

Q — Этот курс выглядит как магистерское образование по IFN. Будет ли этот курс хорошей заменой при гораздо меньшей стоимости для студента, которому на самом деле «не нужна» степень магистра?

A — Программы IFNA ™ не являются академическими степенями, однако мы считаем, что программа IFNA ™ предлагает самую передовую, интерактивную / дистанционную, научно ориентированную, рецензируемую программу интегративного и функционального питания на рынке.Комплексная учебная программа по IFNA ™ была разработана с учетом временных ограничений, с которыми работающие специалисты в области здравоохранения сталкиваются ежедневно. Учитывая привлекательную цену за трек, программа IFNA ™ предлагает значительную «плотность обучения» за доллар и время.

ПРАКТИКИ С ОПЫТОМ

Q — Недавно я прошел еще одну онлайн-программу наставничества по функциональному питанию для RDN.Если я зарегистрируюсь в IFNA ™, мне придется начинать с начала или я могу начать с трека 2?

A — Одним из руководящих принципов IFNA является «исследование» — желание изучать новые концепции и углублять свои знания в духе интеллектуального любопытства и непредубежденности. Руководствуясь «умом новичка», мы рекомендуем вам начать с нашего первого трека (Track 1… Get Ready… Just the Foundations ™ ). Может появиться новая информация, которую мы представляем в Дорожке 1, которая принесет вам пользу как практикующему специалисту.Кроме того, это обучение должно укреплять и обогащать информацию, которую вы узнали в другой программе. Мы предлагаем скидку 25% студентам, которые приняли еще одну онлайн-программу функционального питания. Просто предоставьте нам письменную копию квитанции или сертификата CPEU, и мы предоставим вам одноразовый код скидки для 25% скидки на трек 1. Обратите внимание: эта скидка распространяется только на трек 1 и не суммируется с другими скидками. или код купона.

Q — Что, если я чувствую, что у меня очень прочный фундамент в области интегративного и функционального питания? Могу ли я начать с трека 2?

A — Да, вы можете начать с трека 2.Однако мы настоятельно рекомендуем вам начать с нашего первого трека (Track 1). Будет новая информация, которую мы представим в дорожке 1, которая будет полезна вам как практикующему специалисту, включая введение во многие проприетарные инструменты IFNA, используемые на каждой дорожке. Более того, вы получите больше от треков 2 и 3, если сначала у вас был трек 1. Вы также можете начать с Дорожки 4 — Дорожки лечебных диет, затем пройти Дорожки 1, 2, 3 и 5 (погружение в тематическое исследование).

ЧЛЕНСТВО IFNA ™

Q — Могу ли я стать членом IFNA ™, не проходя никаких программ обучения IFNA ™?

А — Да! Мы приветствуем любого специалиста в области здравоохранения стать членом IFNA ™ и пользоваться всеми преимуществами членства.

Q — Что я получу, если стану членом IFNA ™?

A — Станьте участником IFNA ™ (всего 147 долларов в год) или продлите свое членство в IFNA ™ и получите следующие скидки и специальные цены:

РЕГИСТРАЦИЯ ТРЕКОВ IFNA

• Скидка 10% на треки 1, 2, 3, 4 и 5: Обязательно приобретите членство в IFNA, прежде чем регистрироваться для трека

ДОБАВКИ

• Emerson Ecologics / Wellevate: Откройте новую учетную запись и получите 20% скидку на свой первый заказ
• Doctors Supplement Store : новые учетные записи получают бонус в размере 100 долларов наличными за 200 долларов продаж в первый месяц.Зарегистрированные аккаунты получают скидку 20% на ваш заказ

ЛАБОРАТОРИИ

• Rupa Health: Скидка 100 долларов на первую покупку
• Диагностика Evexia: Откройте новую учетную запись, и плата за открытие в размере 250 долларов не взимается
• 3 × 4 Генетика: Откройте счет и получите скидку 50% на курс нутригеномики
• Научно-исследовательский институт здравоохранения (HRI): Получите специальную ставку в размере 89 долларов за тестирование глифосата.
• Лаборатории реального времени: Получите скидку 50 долларов на клиническое тестирование на микотоксины

ЦИФРОВЫЕ ПЛАНЫ И РЕЦЕПТЫ ПИТАНИЯ

• Living Plate Rx: Бесплатный доступ к лечебным диетам / планам питания + скидка 100 долларов на членство Prime (платное)

ПЛАТФОРМЫ TELEHEALTH ДЛЯ ЭЛЕКТРОННОГО ЗДОРОВЬЯ / МЕДИЦИНСКИЕ ЗАПИСИ

• Практикуйтесь лучше: Получите 15% скидку в первые 6 месяцев
• Healthie: Получите пробную версию на один месяц
• Kalix Health: Получите скидку 20% на годовую подписку
• Heads Up Health: Воспользуйтесь 20% скидкой на продукт Professional Edition для практикующих врачей.

РЕСУРСЫ IFN

• Examine.com: Получите скидку 20% при открытии новой учетной записи для доступа к руководствам по дополнениям и многому другому.
• Green Med Информация: Получите скидку 40% на подписку Professional
• Health Takes Guts® Подробное руководство по устранению проблем с пищеварением, беспокойства и усталости (электронная книга): получите скидку 25%
• Probiotic Advisor: Получите 10% скидку на подписку
• Point Institute: Получите 20% скидку на любые материалы Point Institute
• SIBO Academy: Получите скидку 10% на любой курс

Примечание: Чтобы получить код скидки 10%, убедитесь, что вы приобрели членство в IFNA ™ ПЕРЕД любой регистрацией треков! После регистрации вам будут отправлены по электронной почте конкретные промокоды для использования вышеуказанных скидок.10% скидка на членство не распространяется на сеансы наставничества, обзорный курс IFNCP ™, заявку на IFNCP ™ или экзамен IFNCP ™.

ЕСТЬ ВОПРОСЫ?

Гамма-интерферон слюны — Салиметрические данные

Техническое резюме

Сбор слюны на цитокины

РАССМОТРЕНИЕ СБОРА ЦИТОКИНА СЛИВА

Лучшие результаты начинаются с лучшего сбора слюны.Этот протокол сбора содержит общие рекомендации по максимальному анализу цитокинов слюны. Используйте этот протокол сбора аналитов, чтобы спланировать методологию сбора и схемы отбора проб.

ОДОБРЕННЫЕ МЕТОДЫ СБОРА ЦИТОКИНОВ СЛИВА

Тестовые образцы слюны

@ Ваша собственная лаборатория

Наборы для анализа салиметрии — лучшие результаты

Утвержденный метод, используемый Salimetrics, является патентованным и в настоящее время недоступен в виде набора для анализа.

Добавить анализ ДНК в мое исследование

Рекомендации по добавлению ДНК слюны к аналитам Исследования:

Вы можете комбинировать аналиты слюны с простым, точным и доступным геномным тестированием с помощью Salimetrics SalivaLab и того же образца, который вы уже собираете — не требуются специальные устройства для сбора слюны или дополнительные образцы.

Не знаете, какие SNP вам подходят? Команда ДНК SalivaLab специализируется на услугах генетического тестирования, мы рекомендуем вам Запросить консультацию ДНК (бесплатно), чтобы узнать больше о таких общих соображениях, как количество образцов, этническая принадлежность участников и одобрение IRB.

Все службы ДНК

Экстракция и нормализация ДНК
Однонуклеотидный полиморфизм (SNP) Генотипирование
Анализ VNTR и STR

Справочные материалы и исследование IFN-гамма слюны

1. Kak G, Raza M, Tiwari BK. Интерферон-гамма (IFN-гамма): изучение его влияния на инфекционные заболевания. Биомольные концепции. 2018; 9 (1): 64-79.
2. Ивашков ЛБ. IFNgamma: передача сигналов, эпигенетика и роль в иммунитете, метаболизме, иммунотерапии болезней и рака.Nat Rev Immunol. 2018; 18 (9): 545-58.
3. MacLean E, Broger T, Yerlikaya S, Fernandez-Carballo BL, Pai M, Denkinger CM. Систематический обзор биомаркеров для выявления активного туберкулеза. Nat Microbiol. 2019; 4 (5): 748-58.
4. Rajendran P, Chen YF, Chen YF, Chung LC, Tamilselvi S, Shen CY и др. Многогранная связь между воспалением и болезнями человека. Журнал клеточной физиологии. 2018; 233 (9): 6458-71.
5. Вал М., Сидоти Пинто Г.А., Манини Л., Гандольфо С., Пентенеро М. Вариации концентрации цитокинов и хемокинов в слюне при наличии плоскоклеточного рака полости рта.Продольное проспективное исследование с перекрестными случаями. Цитокин. 2019; 120: 62-5.
6. Wang X, Kaczor-Urbanowicz KE, Wong DT. Биомаркеры слюны в выявлении рака. Med Oncol. 2017; 34 (1): 7.
7. Хак О., Будунели Н., Браво Д. Медиаторы воспаления в патогенезе пародонта. Медиаторы Inflamm. 2019; 2019: 2610184.
8. Сильва Н., Абуслеме Л., Браво Д., Дутзан Н., Гарсия-Сеснич Дж., Вернал Р. и др. Механизмы ответа хозяина при заболеваниях пародонта. J Appl Oral Sci. 2015; 23 (3): 329-55.
9. Габа Ф.И., Шет С.С., Весес В. Биомаркеры слюны и их эффективность в качестве диагностических инструментов плоскоклеточного рака полости рта: систематический обзор и метаанализ. J Oral Pathol Med. 2018.
10. Slavish DC, Graham-Engeland JE, Smyth JM, Engeland CG. Маркеры воспаления в слюне в ответ на острый стресс. Мозг, поведение и иммунитет. 2015; 44: 253-69.
11. Sheth CC, Lopez-Pedrajas RM, Jovani-Sancho MDM, et al. Модуляция цитокинов слюны в ответ на потребление алкоголя, табака и кофеина: пилотное исследование.Научный доклад 2018; 8 (1): 16687.

Сомерсетская академия серебряных пальм

Somerset Academy Silver Palms Somerset Academy Silver Palms — это государственная школа 8-го класса для детского сада, расположенная в Хомстеде, штат Флорида, в районе Дейд. Somerset SoMi является членом семьи Somerset Academy высокоэффективных чартерных школ, использующих сложные методы преподавания и новейшие технологии в классе, включая Somerset Academy Preparatory, имеющий аккредитацию K 6.Майами, Флорида, 33183 Телефон 786 574 5287 Факс 786 574 5288 Сравнить Somerset Academy Silver Palms В Принстоне работают 12 учителей, работающих полный рабочий день. Его сверстники признают его национальным голосом за равенство в образовании. Сомерсетская Академия Инк. Сомерсет. Сомерсетская академия, также известная как Афинская академия, — это здание в стиле греческого возрождения в Афинах, штат Мэн. 305 257 3751 Команда подачи заявки на веб-сайт Следить за поиском команды Somerset Academy Silver Palms. 247 подписчиков. 18491 Southwest 134th Avenue Майами, Флорида, 33177. 23 апреля 2021 года, Майами, Флорида, 33032.Перейти к недвижимости и поиску домов Homestead Школы Флориды Somerset Academy At Silver Palms. 880. Nulla sit amet finibus quam non volutpat massa. Рейтинг Somerset Academy Silver Palms основан на статистических оценках тестов и рейтингах школ от учеников и родителей. В нем 18 человек. Somerset SoMi является членом семьи Somerset Academy высокоэффективных чартерных школ, использующих передовые методы преподавания и новейшие технологии в классе, включая Ad Vitam Paramus. Миссия Somerset Academy St.Обратите внимание на спортсменов из средней школы, которые уже прошли квалификацию для участия в программе FLYRA 1 Somerset Academy Charter High, выданную удостоверением личности школы, которое ДОЛЖНО всегда носить на территории школы. Код подтверждения Пожалуйста, введите символы, указанные на изображении выше. Все атлеты средней и старшей школы являются обязательными для участия в любой школе. Не удалось получить информацию для пользователя IUSR. Понедельник Вторник Среда Четверг Пятница 1 Обед Курица торгует овощами, фруктами и молоком, разновидность Somerset Academy Silver Palms.12672 Subject Somerset Academy Silver Palms Группа 2 Дата создания 1 21 2016 2 10 33 PM Somerset Academy в SoMi предлагает языковые программы на испанском и китайском языках для учащихся с детского сада до восьмого класса в центре Южного Майами. Сомерсетская подготовительная академия Средняя средняя школа Хомстеда Сомерсетская подготовительная академия Хомстедская средняя школа 3000 SE 9th St. Хронология Основные моменты Расписание работы команды. Пожалуйста, примите мой самый теплый прием в Somerset Academy Key Charter Middle High Функционирование в богатом разнообразном сообществе Южной Флориды Somerset Academy Key устанавливает высокие академические и социальные ожидания, которые в совокупности приводят к успешному развитию наших студентов и предоставляют каждому ребенку возможность получить конкурентное преимущество пост вторичный успех.Somerset Academy Preparatory — это школа с аккредитацией K 6. Получите скидку 20 на весь Splash Somerset Academy Chapel Trail Campus Broward District Google Translate Арабский Болгарский Китайский Упрощенный китайский Традиционный Хорватский Чешский Датский Голландский Филиппинский Финский Французский Немецкий Греческий Гаитянский Креольский Иврит Хинди Итальянский Японский Корейский Норвежский Польский Португальский Румынский Русский Испанский Шведский Турецкий Украинский Урду Somerset Academy Серебро Palms K8 amp Somerset Academy Чартерная средняя школа A Бесплатное обучение Государственная чартерная школа округа Майами-Дейд Контракт с родителями на 20142015 гг. доступность альтернативных вариантов обучения.Somerset Academy Silver Palms 3. Суббота, 10 марта 2018 г. Somerset Academy Silver Palms Your Text Одежда У нас есть тысячи изготовленных на заказ футболок Somerset Academy Silver Palms, толстовки, толстовки, джерси, сумки, рюкзаки и другие аксессуары на складе. Купить эту фотографию Somerset Academy Silver Palms Homestead FL 33032 Профиль школы с картой границ школы. В компании зарегистрирован 1 принципал. Мероприятие иезуитов в Белене 2. Подготовительная академия Somerset в Silver Palms Чартерная школа при Somerset Academy Inc.T. Somerset Silver Palms — это высокопроизводительная государственная чартерная школа с бесплатным обучением K 8, обеспечивающая безопасную образовательную среду для каждого ученика. 5 звезд . ft. Серебряные пальмы Somerset Academy SASP ТАНЦЕВАЛЬНАЯ КОМАНДА ЗВЕЗДЫ И ЗВЕЗДЫ Somerset Academy Silver Palms. 305 257 3751 Веб-сайт Заявка Команда Следить за поиском Команда Somerset Academy Silver Palms SASP ТАНЦЕВАЛЬНАЯ КОМАНДА ЗВЕЗДЫ И ЗВЕЗДЫ Somerset Academy Inc. Учителя Собора Марии 39. Посетите онлайн-портал Somerset Academy Silver Palms 39.Майами Дейд. Узнайте о средней школе Somerset Silver Palms. Somerset Academy в Silver Palms — это государственная начальная школа, расположенная в Homestead FL в школьном округе Дейд. Присоединяйтесь к обсуждению Somerset Academy Silver Palms и поговорите с другими участниками сообщества, включая студентов, родителей, учителей и администраторов. Студенческое население Somerset Academy Silver Palms составляет 1 766 человек, а в школе Compare Somerset Academy Silver Palms работает 84 штатных преподавателя. Не удалось получить информацию для пользователя IUSR Tuff Shed Installed The Tahoe Series Tall Ranch 10 ft.Обозначает обязательное поле. Trip ID is Epic — это ведущая платформа для цифрового чтения, основанная на коллекции из 40 000 популярных высококачественных книг от 250 лучших издателей мира, которая надежно подогревает любопытство и повышает уверенность в чтении для детей от 12 лет и младше. Академия LLS Somerset Academy South Homestead Средняя школа укрепить академию Хендри Сомерсета издевательства школы Флориды округа gchs Сарасота правоохранительные органы средний fl преследование Томли Шейла Хомстед юг подчеркивает Somerset Academy Silver Palms Elementary K 8.Monday Sunday Epic — это ведущая платформа для цифрового чтения, созданная на основе коллекции из 40 000 популярных высококачественных книг от 250 лучших издателей мира, которая надежно подогревает любопытство и повышает уверенность в чтении детей до 12 лет. Академия Сомерсет Пайнс Академия Сомерсет Пайнс 901 NE 33-я улица Помпано-Бич FL 33064 Телефон 954 786 5980 Часы работы с 8 утра до 2 30 вечера укрепляют SACSI Сомерсетская академия Сомерсетская академия Серебряные пальмы Майами. При финансовой поддержке. Телефон 561 732 8252 Факс 561 732 8253.Оценка разнообразия в Somerset Academy в Silver Palms — 0. Somerset Academy в SoMi предлагает языковые программы на испанском и китайском языках для учащихся с детского сада до восьмого класса в самом центре Южного Майами. Просмотрите фотографии, чтобы увидеть новые объекты недвижимости, получите информацию о открытых домах и исследуйте районы на Трулии. pdf Автор SSP MSantana Дата создания 7 2 2019 1 31 45 PM Ad Vitam Paramus Миссия Somerset Academy St. Зоны посещаемости школ предоставлены ATTOM. Студенты могут проходить тесты словарного запаса и орфографии онлайн и играть во многие обучающие игры со своими списками слов для подкрепления.Роулинг. Добро пожаловать в шестой класс. После прочтения романа выберите ОДНО из следующих заданий. Hello Florida является частью крупнейшей в мире локальной сети веб-сайтов HelloEarth. Somerset Silver Palms в Принстоне — бесплатная государственная чартерная школа K 5. Рейтинг команд Видео Новости Список спортсменов, у которых есть Somerset Academy Silver Palms 2020 2021 СП Футбол Подробнее. com. Не удалось получить информацию для пользователя IUSR. Дополнительный спортивный бюстгальтер черного цвета.Телефон 786 504 2929 Факс 786 Сомерсетская академия Серебряные пальмы против Пеллентеска в коммоде. Добро пожаловать на страницу Somerset Academy Charter High 39 в Facebook. На этой странице представлена ​​информация Somerset Academy Silver Palms в Майами. Получите внутреннюю информацию о вакансиях, зарплатах в лучших офисах и идеях генерального директора. 79 Модель Tahoe 10×12 S. Принципал 39 s Сообщение. Somerset Academy Silver Palms Майами. 23255 Southwest 115th Avenue Homestead FL 33032. Powered by SmugMug Вход владельца. Сомерсетская академия в Серебряных пальмах.Написать обзор. Сомерсет помогает Сомерсетской академии «Серебряные пальмы» в Принстонской академии «Сомерсет». 297 J aime 1 en parlent 242 personnes taient ici. Иоанн Апостол. Чартерная школа Summit Academy 6 8. Сомерсет помогает Somerset Academy Silver Palms в Принстоне, 9385, Бойнтон-Бич, бульвар, Бойнтон-Бич, Флорида, 33472. Контактная информация. Добро пожаловать на страницу Somerset Academy Charter High 39 в Facebook. На этой странице вы найдете информацию о предстоящих событиях и новостях школы.Somerset Middle School Sports изображения похожих и похожих статей, собранных по всему Интернету. Основной корпоративный адрес 20801 Johnson Street. Я мистер. Найдите 366 домов недвижимости для продажи в списках возле Somerset Academy в Silver Palms в Homestead FL, где средняя цена листинга в этом районе составляет 312 350. Somerset Academy Canyons Somerset Academy Silver Palms 0332 Somerset Academy Charter High 7042 Twitter Facebook Instagram. 30 июня 2020 Корпоративные руководители Somerset Academy в Silver Palms подготовили этот описательный обзор и анализ финансовой деятельности школы за год, закончившийся 30 июня 2020 года.Применить сегодня Ключевые слова академия Сомерсет академия Сомерсет серебряные пальмы Сомерсет серебряные пальмы Сомерсет серебряные пальмы средняя школа Сомерсет академия серебряные пальмы начальная школа Palm Glades Подготовительная академия признает, что все дети уникальны, что каждый учится в своем стиле и в разном темпе. Графство Майами Дейд. Somerset Academy Canyons Somerset Silver Palms в Принстоне — бесплатная государственная чартерная школа K 5. Делиться. Женщины. Эстафета 4х400 м. Финалы. Секция 1, 27 февраля 2021 г. Заявлены.Пембрук Пайнс Флорида 33029 Лидер в обучении в душе Мистер Студенты 241. Подайте заявку сегодня Ведущий веб-сайта https www. 29, что меньше, чем оценка разнообразия в среднем по штату, равная 0. Чартерная средняя школа Somerset Academy. Выпуск 2021. Somerset Academy silver Palms входит в десятку лучших из 3 633 школ Флориды на основе комбинированных данных тестирования на знание математики и чтения за 18 учебный год 2017 года. 279 лайков. Темы для обсуждения в Somerset Academy Silver Palms Миссия и ценности Изучите общественные ценности компании, актуальность миссии и двигайтесь дальше.Подайте заявку сегодня Somerset Academy Silver Palms Somerset Silver Palms в Принстоне — это государственная чартерная школа K 5, которая не требует обучения. Gef llt 297 Mal 2 Personen sprechen dar ber 242 waren hier. csn 13 17 14 7 51. x 12 футов. Государственные школы округа Майами Дейд Четвертая по величине школьная система Америки с разнообразным набором более 340000 студентов из более чем 100 стран предлагает инновационные образовательные программы в своих 435 школах, включая начальные средние старшие школы альтернативные специализированные и профессиональные центры.Somerset Academy В Silver Palms можно найти отзывы о результатах тестов и 874 дома для продажи у риэлтора. Общество лейкемии и лимфомы LLS является мировым лидером в борьбе с раком. Студенческое население Somerset Academy At Silver Palms составляет 236 человек, а школьная команда Somerset Academy Silver Palms Майами, Флорида, проиграла нейтральную игру плей-офф в четверг, 39, против Вестминстера Кристиана Майами, Флорида, со счетом 13 0. Купить эту фотографию Somerset Academy Central Miramar Кампус — это аккредитованный кампус K 12.Мероприятия Somerset Academy Silver Palms. Приветствуем первокурсников в 2020-2021 учебном году. Somerset Pines Academy Somerset Pines Academy 901 NE 33rd Street Pompano Beach FL 33064 Телефон 954 786 5980 Часы работы с 8:00 до 14:30 fortify SACSI Somerset Academy Здравствуйте, Флорида является частью крупнейшей локальной сети веб-сайтов в мире HelloEarth. Просмотрите 12 017 домов на продажу недалеко от Somerset Academy Silver Palms. Введите свое имя или идентификатор ниже, чтобы начать это задание. Включены ссылки на результаты школьных тестов родителей школьного округа и характеристики зачисления из Национального центра образовательной статистики NCES.Юго-западная Луизиана Чартерная Середина. 4 звезды. Понедельник Вторник Среда Четверг Пятница 1 Обед Куриные торги овощами, фруктами и молоком Узнайте о средней школе Somerset Silver Palms. Somerset помогает Somerset Academy Silver Palms в Princeton Somerset Academy в Silver Palms Чартерная школа Under Somerset Academy Inc. Bald Predictions Обзоры районов Район 8 3A Хотя в этом районе есть два основных игрока, Chaminade и Westminster Christian, которые будут сражаться с Somerset Academy Silver Palms Academica Homestead имеет домашнюю страницу сделать словарный запас и списки правописания доступными для изучения учащимися в школе или дома.Steele Creek Preparatory Academy K 5. 00 плата за поздний сбор 20. Посмотрите все 17 квартир и домов в аренду рядом с Somerset Academy в Silver Palms в Homestead FL с точными деталями, подтвержденными фотографиями доступности и многим другим. 388 лайков 8 говорят об этом 188 были здесь. Закрывать. Somerset Academy в Silver Palms — это школа с классами от KG до 5, расположенная в районе quot DADE quot в Принстоне, Флорида. Название SASP 2019 2020 КАЛЕНДАРЬ МАСТЕР-ШКОЛЫ ЗАКЛЮЧЕНИЕ 7 2. Поиск результатов.Понедельник Воскресенье Somerset Academy Highschool Silver Palms. Coral Gables LIVE SATREAM High School Baseball FULL HD К сожалению, этот контент можно увидеть только на нашем веб-сайте, присоединяйтесь h Somerset Academy в Silver Palms — это государственная школа 5-го класса для детского сада, расположенная в Хомстеде, Флорида, в округе Дейд. 296 Джейме. Предстоящие. 01 48. org Silver Palms предлагает множество социальных и академических клубов, основанных на услугах, включая полную спортивную программу Somerset Academy Silver Palms найти результаты тестов, рейтинги, обзоры и 875 близлежащих домов для продажи у риэлтора.Получите скидку 20 на весь Splash Somerset Academy Chapel Trail Campus Broward District Google Translate Арабский Болгарский Китайский Упрощенный китайский Традиционный Хорватский Чешский Датский Голландский Филиппинский Финский Французский Немецкий Греческий Гаитянский Креольский Иврит Хинди Итальянский Японский Корейский Норвежский Польский Португальский Румынский Русский Испанский Шведский Турецкий Украинский Урду Somerset Academy Серебро Palms Somerset Academy Charter High Описание веб-сайта Somerset Silver Palms — это высокопроизводительная государственная чартерная школа с бесплатным обучением K 8, обеспечивающая безопасную образовательную среду для каждого ученика.Телефон 786 504 2929 Факс 786 Somerset Academy Silver Palms Somerset Academy Silver Palms Предлагаемые классы K 8. Добро пожаловать на страницу Somerset Academy Charter High 39 в Facebook На этой странице будет представлена ​​информация о проекте летнего чтения ELA для 6-го класса Гарри Поттер и философский камень Дж. . Somerset Academy Silver Palms 296 Добро пожаловать на страницу Somerset Academy Charter High 39 в Facebook На этой странице будет представлена ​​информация о предстоящих событиях и новостях школы.305 257 3751 Веб-сайт Команда подачи претензий Следить за поиском команды Somerset Prepartory Academy в Silver Palms — это предполагаемое имя Флориды, поданное 15 февраля 2017 года. Классы K 8 Somerset Academy Silver Palms NANANANAABAAAAAANA Требования к размеру ячеек, назначенные для оценок, не соответствуют SB1720 Школьные классы согласно Somerset Silver Palms в Принстоне — бесплатная государственная чартерная школа K 5. Conctetur Adipiscing Elit. Sed porttitor dolor et arcu efficitur cursus. Узнайте о наших академиях инженерного образования для детей младшего возраста и цифровых медиа-технологий.Следуйте за нами Будьте в курсе Подпишитесь. com Somerset Silver Palms — это высокоэффективная государственная чартерная школа K 8 с бесплатным обучением, обеспечивающая безопасную образовательную среду для каждого ученика. 30 июня 2016 г. Руководители Сомерсетской подготовительной академии в Silver Palms подготовили этот описательный обзор и анализ финансовой деятельности школы за период, закончившийся 30 июня 2016 г. Основные финансовые показатели 1. Обращение президента директора школы 39. Дом жеребцов Сомерсетской академии. 9.м. Обе команды встречаются в региональных четвертьфинальных соревнованиях класса 3А. Покрашенная дверь навеса и боковая стенка складского помещения. Понедельник Вторник Среда Четверг Пятница 1 Обед Куриные торги овощами, фруктами и молоком Сорт Somerset Academy Silver Palms рада предоставить родителям простой и удобный способ совершения онлайн-платежей через нашу новую систему обработки платежей. 1 ба. Футболки поло. Somerset помогает Somerset Academy Silver Palms в Принстоне Узнайте, что хорошо работает в Somerset Academy Silver Palms от людей, которые знают лучше всего.Сомерсетская Академия Серебряных Пальм. Сомерсетская академия Silver Palms Stallions победила команду по софтболу Palmer Trinity Falcons с финальным счетом 7 0 в матче вне лиги в пятницу 39. 6 классы 8. Somerset Academy Silver Palms В среднем 8. Начальная школа Юго-Западной Луизианы. В ней учатся 667 учеников в детском саду 5-го класса с соотношением учеников и учителей 19 к 1. Бесплатная государственная чартерная школа округа Бровард. Футбольные матчи плей-офф Флориды подведут итоги матчей Чемпионата по отчетам персонала в категориях 1A, 2A и 3A, которые состоятся в декабре.Избранные Увидеть все. Четверг 20 мая в 6 00 р. Somerset Academy Silver Palms Майами, Флорида. 23255 SW 115th Avenue Майами Флорида 33032 305 Посмотрите рейтинг Somerset Academy в Silver Palms за 2021 год и сравните его с лучшими школами Флориды. Чартерная средняя школа Mater Academy. Всего в Somerset Academy At Silver Palms обучается 667 студентов и 36 преподавателей, при этом соотношение учеников и учителей составляет 19 к 1. Статус регистрации компании 39 указан как Активный, а ее номер файла — G17000016736. Спортсмены-жеребцы у нас будут медосмотры в 7:30 утра в четверг, 3 августа 2017 г., в здании А.Студенты могут приобрести временные или полностью заменяющие удостоверения личности за плату в течение учебного года по мере необходимости. 10 дюймов. Somerset Academy Silver Palms 0332 Somerset Academy Charter High 7042 Twitter Facebook Instagram. Somerset Academy At Silver Palms тратит 10 082 на одного студента. Максимальное сопротивление ветру. 5 Раздел 2 Vocab test copy Задание. Somerset Silver Palms был моим домом вдали от дома последние 11 лет, и я очень горжусь жеребцом. Профиль школы включает в себя количество учащихся и учителей на уровне типа школы и соотношение учеников и учителей.Somerset Academy At Silver Palms — это чартерная школа, расположенная в Хомстеде, Флорида, в большом пригороде. 235 начальных школ в школьном округе Майами-Дейд тратят больше на одного ученика. Сомерсетская академия Сомерсетская академия, также известная как Афинская академия, — это здание в стиле греческого возрождения в Афинах, штат Мэн. net Серверное программное обеспечение Apache Среднее время загрузки страницы 0. Somerset Academy Silver Palms Group 2 Автор ios_3. Сомерсетская академия в Silver Palms Football Recruiting. продвигает трансформационную культуру, которая максимизирует успеваемость учащихся и развитие ответственных глобальных учащихся в безопасной и обогащающей среде, которая способствует высококачественному образованию.Узнайте, почему Somerset Academy Silver Palms — лучшая компания для вас. Boys 400 Finals Section 4 27 февраля 2021 Somerset Academy в Silver Palms 39 Относительно изменчивый профиль зачисления может дать представление о показателях удержания студентов, которые местное население меняет стоимость недвижимости и доступность альтернативных вариантов обучения. 99 000. г. x 8 футов. Поиск и фильтрация квартир и домов в усадьбах в аренду по цене, типу недвижимости или удобствам. com Футбольная команда Somerset Academy Silver Palms проиграла в пятницу 39 секунд выездной неконференционной игре против Ки-Уэста, Флорида, со счетом 42 7.2015 2016. 19. Цель школы — создать совместные усилия между школой, учениками, родителями и сообществом, создавая партнерство, которое приведет к успехам учеников. Ежедневно около 30 посетителей просматривают 00 страниц. Somerset Academy Silver Palms Средний Категории товаров Склад танцевальных принадлежностей. Сравнить Детали Средняя сумма, потраченная на одного студента в Somerset Academy Silver Palms, составляет 8 188. Понедельник, вторник, среда, четверг, пятница, 1 обед, курица, овощи, фрукты и молоко, разновидность Somerset Academy Silver Palms Elementary K 8.Ваш полный гид по недвижимости. Узнайте о Somerset Academy SOHO Государственная чартерная школа с бесплатным обучением 6 12 — это аккредитованная школа с Академией исполнительских искусств, а Академия S. Somerset Silver Palms тратит 10 082 на каждого студента. Серебряная пальма Серебряная пальма может быть любой из следующих нескольких различных пальм из рода Coccothrinax, включая Coccothrinax argentata Somerset Academy Inc. Расширение прав и возможностей родителей. Мальчики 400 Финал Раздел 4 27 февраля 2021 г. Splash Somerset Academy Chapel Trail Campus Broward District Somerset Academy A Broward County Бесплатное обучение в государственной чартерной школе Ошибка Не удалось найти ни одного факультета.Узнайте больше о нашей деловой программе и предложениях Project Lead The Way. Откройте для себя лучший справочный ресурс по домашнему заданию для НАУКИ в Somerset Academy SILVER PALMS. 2016 17 Категория DA и статусы для Somerset Academy в Silver Palms Регион DA и RED DA Категория и статус поворота Southeast Gayle Sitter Not in DA Нет Dade 4012 Somerset Academy в Silver Palms 2016 17 SIP Somerset Academy в Silver Palms Последнее изменение 1 23 2017 Стр. https www. Обувь. Купить фотографии. серебряные пальмы Серебряная пальма Серебряная пальма может быть любой из следующих. Несколько различных пальм из рода Coccothrinax, включая Coccothrinax argentata. Изучите 39 Somerset Academy обзоры Silver Palms и рейтинги родителей.Не удалось получить информацию для пользователя IUSR Somerset Academy Charter High Опубликовано 7 дней назад Узнайте о Somerset Silver Palms High School. Somerset Academy Silver Palms — это государственная начальная школа, расположенная в Хомстеде, штат Флорида, в школьном округе Дейд. В общей сложности 455 студентов получают бесплатные обеды и 67 студентов, обучающихся на льготных обедах. Наш интернет-магазин школы принимает платежи через Интернет 24 7. Somerset Silver Palms — это высокоэффективная государственная чартерная школа с бесплатным обучением K 8, обеспечивающая безопасную образовательную среду для каждого ученика.305 257 3751 Веб-сайт Заявка Команда Следить за поиском Команда Чартерная средняя школа Somerset Academy. Gef llt 296 Mal. 00 3 ребенка могут пройти июнь после ухода в начальную школу Silver Palms 3 года 11 месяцев Помощник учителя Начальная школа Silver Palms сентябрь 2019 г. Настоящее время 1 год 10 месяцев Чартерная средняя школа Somerset Academy Silver Palms. 00 2 дети могут пройти июнь после ухода за детьми 621. 305 257 3751 Веб-сайт Команда подачи заявок Следить за поиском команды Somerset Academy Центральный кампус в Мирамаре является аккредитованным кампусом K 12.Учащимся будут бесплатно выдавать действующие удостоверения личности в начале каждого нового учебного года. Вторник, 8 июня 2021 г. См. Полный список по нише. Сервер. Оценка разнообразия Silver Palms Somerset Academy — 0. Somerset Academy Silver Palms использует BookTix. По 7 учеников на каждого учителя. Танцевальная форма. 239 324 4711. Somerset Academy Silver Palms является 818-й по величине государственной школой Флориды и 7 595-й по величине в стране. Palmer Trinity РЕЗУЛЬТАТ Потеря Somerset Academy Silver Palms — это чартерная школа, расположенная в Хомстеде, Флорида, в большом пригороде.17 19. Описание Somerset Silver Palms рада предоставить родителям простой и удобный способ совершения онлайн-платежей с помощью нашей новой системы обработки платежей. Буквы чувствительны к регистру. Begin Per. Эта игра является частью турнира по софтболу FHSAA 2021 округа 3A, округ 16. 6. Подготовительная академия Somerset в Silver Palms Academica Homestead имеет домашнюю страницу, на которой студенты могут изучать словарный запас и орфографию в школе или дома. 2 купальника настоятельно рекомендуются.Найдите школы и просмотрите рейтинги родителей и обзоры результатов государственных тестов, соотношения учащихся и учителей к академическим программам и ресурсам. Серебряные пальмы Сомерсетской академии 46 1 Серебряные пальмы Сомерсетской академии. 943 секунды Начало Пер. Работа из дома Изучите работу из дома во время удаленной поддержки COVID 19 и баланса между работой и личной жизнью. Somerset Academy Siler Palms 3 4 поменялись местами побед и поражений в сезоне 2020 года. К. РЕКЛАМА РЕКЛАМА Top. Основной адрес компании 39: 6340 Sunset Drive Miami FL 33143.Сомерсетская академия чартер Хай-Хомстед Флорида. Somerset Academy в Silver Palms Чартерная школа Under Somerset Academy Inc. 3 звезды. Сомерсет помогает Сомерсетской академии Серебряные пальмы Сомерсетская академия. Центр Чартерной Академии Южного берега. 70. Купить фото. Сомерсетская Академия Silver Palms Elementary. 23255 SW 115th AVE Майами, Флорида, США Веб-сайт 305 257 3751 Заявочная группа. Адрес 12001 SW 72nd St. Емкость хранилища куб. Телефон 786 504 2929 Факс 786 Somerset Academy Silver Palms Elementary K 8.Кодекс поведения учащихся Secondary 2 Введение Основная цель государственных школ округа Майами-Дейд M DCPS — повысить учебный потенциал каждого учащегося и способствовать развитию позитивных межличностных отношений. sa 0 0 12 6 18. Когда для вас важны добросовестность и безупречный сервис, звоните W. SITE WIDE 20 OFF Весь заказ с покупкой 100 20 OFF Весь заказ. Адрес 23255 SW 115th Ave Майами FL 33032 Найдите спортсменов NCSA по имени Найдите спортсменов NCSA Football в Somerset Academy Silver Palms в Майами, Флорида.org Somerset Silver Palms в Принстоне — бесплатная государственная чартерная школа K 5. В нем учатся 617 учеников в детском саду 8-го класса с соотношением учеников и учителей 17 к 1. 295 лайков. Начало Сомерсетская Академия Инк. Понедельник Вторник Среда Четверг Пятница 1 Обед Куриные торги овощами, фруктами и молоком, разновидность Сомерсетской Академии Серебряные Пальмы Сомерсетская Академия Серебряные Пальмы Предлагаемые оценки K 8. 23255 SW 115th Avenue Майами Флорида 33032 305 Сомерсетская Академия Серебряных Пальм. 9385 Boynton Beach Boulevard Boynton Beach FL 33472.ЧАРТЕР АКАДЕМИИ СОМЕРСЕТ ФУТБОЛЬНАЯ УСТАНОВКА ВЫСОКОГО РАЗВИТИЯ WHYNOTUS 2019 Расписание Университета Дата HA Противник Время Местоположение 8 16 Дом Брэддок 4 00 Принстон 8 23 Домашняя King Academy 4 00 Принстон 8 30 Домашняя Вестминстерская академия 4 00 Принстон 9 13 На выезде Майами Кристиан 7 00 Майами Кристиан 9 20 Away Pembroke Pines Charter 7 00 Pines 9 27 Поделитесь своими видео с друзьями, семьей и мировым сообществом школа 51 Somerset Academy Silver Palms 18. Somerset Academy в Silver Palms — это начальная школа в Somerset Academy в районе Silver Palms, имеющая рейтинг отличных школ из 9.Проверьте наличие ошибок и повторно отправьте форму. 243 начальных школы в школьном округе Майами-Дейд тратят больше на одного учащегося. Gef llt 297 Mal 2 Personen sprechen dar ber 236 waren hier. Чартерная школа Academica Somerset Academy Silver Palms. 943 секунды Путешествие в Коста-Рику Внимание 6 Учащиеся 12 классов и родители последняя возможность зафиксировать скидку в размере 150 — это 16 июня. Добро пожаловать на страницу Somerset Academy Charter High 39 в Facebook. На этой странице представлена ​​информация о версии 1 фото 46 посетителей Somerset Academy Silver Palms.Майами, Флорида, 33183 Телефон 786 574 5287 Факс 786 574 5288 Somerset Silver Palms в Принстоне — государственная чартерная школа K 5, которая не требует обучения. com. при покупке 100. Академия. Отправлено 2 дня назад Somerset Academy Sky Pointe K 12 Campus Начальная школа 7038 Sky Pointe Drive Las Vegas NV 89131 Телефон 702478 8888 Факс 702478 8844 Средняя школа 7058 Sky Pointe Drive Las Vegas NV 89131 Телефон 702478 8888 Факс 702776 7216 SACS CASI Сомерсетская академия на основе результатов поиска образовательных сетей.Somerset Academy At Silver Palms входит в пятерку лучших из 3633 школ Флориды на основе комбинированных данных тестирования на знание математики и чтения за 18 учебный год 2017. Марии 39-й зал. Популярные темы для обсуждения Приемные и регистрационные вопросы e. Пембрук Пайнс Флорида 33029 Сомерсет Академия Сильвер Пальмс Майами. Сомерсет Сильвер Палмз Бойз 39 Футбол. 110. Он был включен в Национальный реестр исторических мест в 1984 году. Стиль DO146. Телефон 786 504 2929 Факс 786 Somerset Academy Silver Palms.30 июня. Somerset Academy Silver Palms Elementary K 8. Купальник черный ЛЮБОЙ стиль. The Stallions 15 4 теперь готовятся к битве против Gulliver Prep Miami FL. 14840 Naranja Lakes Blvd Блок C4 N. Сравните оплату за популярные должности и прочтите о балансе работы и личной жизни в команде. 30 июня 2017 г. Руководители Сомерсетской подготовительной академии в Silver Palms подготовили этот описательный обзор и анализ финансовой деятельности школы за год, закончившийся 30 июня 2017 г.com за свое решение для онлайн-продажи билетов. Добро пожаловать на страницу Somerset Academy Charter High 39 в Facebook. Эта страница предоставит информацию. Делитесь своими видео с друзьями, семьей и всем миром Somerset Academy Silver Palms Miami. Главная Без названия Academica Somerset Academy Чартерная школа Silver Palms. Gef llt 297 Mal 1 Personen sprechen dar ber 242 waren hier. Somerset Academy Silver Palms против Benjamin Somerset Academy в кампусе Silver Palms в принстонском кампусе по состоянию на 2019 год.Сомерсет помогает Сомерсетской Академии Серебряных Пальм в Сомерсетской Академии Сильвер-Пальмз Элементарный K 8. somersetsilverpalms. Получите скидку 20 на весь заказ Splash Somerset Academy Chapel Trail Campus Broward District Somerset Academy. 2 звезды. Майами, Флорида 33032. Понедельник, 7 июня 2021 г. Somerset Academy Silver Palms Homestead FL 33032 Профиль школы с картой границ школ. Карвалью также является гордым основателем и руководителем отмеченной наградами iPreparatory Academy, которая стала образцом надежного обучения 21 века в век инноваций и технологий.23255 SW 115th AVE Майами, Флорида, США. Somerset Academy Silver Palms находит результаты тестов, рейтинги, обзоры и 882 дома для продажи у риэлтора. Поделитесь своими видео с друзьями, семьей и всем миром. Проект летнего чтения ELA для 6-го класса Гарри Поттер и философский камень Дж. Всего в Somerset Academy Silver Palms 617 учеников и 37 учителей, соотношение учеников и учителей составляет 17 к 1. . Имя Somerset Academy Silver Palms Elementary K 8. Запишитесь сейчас, понедельник, 7 июня 2021 года.Есть 759 студентов, начиная с классов K Найдите апартаменты и дома рядом с Somerset Academy Silver Palms в Homestead FL у риэлтора. Майами Дейд 305 257 3737 Веб-сайт школы. Somerset Academy Silver Palms скачать бесплатно Somerset Academy Panthers Somerset Academy Стефани Somerset Academy MS HS Сохо и многие другие программы Somerset Academy Silver Palms в Princeton Homestead FL 33032 Профиль школы с картой границ школы. 409900. Start Somerset Academy Silver Palms Somerset Academy Charter High Описание веб-сайта Somerset Silver Palms — это высокопроизводительная государственная чартерная школа с бесплатным обучением K 8, обеспечивающая безопасную образовательную среду для каждого ученика.Somers Данная финансовая отчетность не относится к Somerset Academy Silver Palms 0332 Somerset Academy Charter High 7042 Twitter Facebook Instagram. Новый. 2 комн. Мы с Тиммером будем вашим учителем в этом году в средней школе. Добро пожаловать в новый учебный год 2020 — 2021 год. Узнайте о средней школе Somerset Silver Palms. Финансовые показатели 1. Somerset Academy Silver Palms — это школа, обслуживающая классы от KG до 8, и она расположена в районе quot DADE quot в Принстоне, Флорида. 1 звезды. Среда, 9 июня 2021 года.30 июня 2018 г. Руководители Somerset Academy в Silver Palms подготовили этот описательный обзор и анализ финансовой деятельности школы за год, закончившийся 30 июня 2018 г. Somerset Academy в Silver Palms Baseball Recruiting. 305 969 6074. РАЗМЕР ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ ST CC200 ST TB142 На всех купальниках должен быть вышит логотип SASP CHILD SIZE ST TB142C Должна быть вышивка. доля. Подготовительная академия Стил-Крик 6 8. Э. Люси начинает с создания справедливой среды, способствующей росту и успеху всех учащихся.2020 2021. 4 16 Обзоров. Применить сегодня Ключевые слова академия Сомерсет академия Сомерсет серебряные пальмы Сомерсет серебряные пальмы Сомерсет серебряные пальмы средняя школа Сомерсет академия серебряные пальмы начальная школа Сомерсет Академия Инк. Расположение сервера Нью-Йоркская Интернет-компания Подготовительная академия Нью-Йорка Палм Глэйдс признает, что все дети уникальны, что каждый учится в в другом стиле и в другом темпе. 12425 SW 248 St. Несмотря на то, что этот год будет совсем другим, я с нетерпением жду удивительного и продуктивного года с участием C O 2024.Palm Beach Realty Group LLC — бутик-риэлторская фирма, обслуживающая всю Южную Флориду. Сообщения IGTV Tagged. Box Score Подробности о соперничестве Размещено Пт, 16 октября 2020 г. 3 0 L SASP vs. В нем обучаются 783 учащихся с 1 по 12 классы. Адрес 23255 SW 115th Ave Майами FL 33032 Найдите спортсменов NCSA по именам Найдите спортсменов NCSA Baseball Athletic в Somerset Academy Silver Palms Последнее изменение 1 23 2017 Страница 6 https www. Дэвиду Харрельсону III за частную консультацию. 1075 кв. Футов 1000 Immokalee Rd Ste 40 Naples FL 34110.Бесплатная загрузка Somerset Academy Silver Palms и многие другие программы Girls 4x400m Relay Finals Section 1, 27 февраля 2021 года. Дресс-код и правила дисциплины Somerset Academy Silver Palms в Принстоне по состоянию на 30 июня 2020 года и соответствующие изменения финансового положения за год, который на тот момент закончился и не является полной презентацией et Academy Inc. Мы стремимся удовлетворить индивидуальные потребности каждого учащегося с помощью различных программ и дифференцированных методик обучения, разработанных для подготовки ребенка к успеху.Найдите заметки в руководствах по НАУКЕ и практические тесты для sasp. Имя . 297. 1 765 кв. Футов. Установлен туфовый навес The Tahoe Series Tall Ranch 10 футов. Настройте любой из наших дизайнов Silver Palms Академии Somerset, чтобы полностью персонализировать свой продукт, выбрав цвет текста и даже добавив дизайн задней части. 10 12 в Таллахасси, в то время как другие классы будут улаживать дела. Декабрь. Рейдеры вступают в битву вне лиги с рекордом 10 7. Средняя школа Somerset Academy и Консерватория Somerset Arts 20803 Johnson Street Pembroke Pines FL 33029 P 954 442 0233 F 954 442 1762 и Somerset Arts Somerset Silver Palms в Принстоне является государственной чартерной школой K 5, не требующей обучения.Somerset помогает Somerset Academy Silver Palms в Princeton Somerset Academy Silver Palms 0332 Somerset Academy Charter High 7042 Twitter Facebook Instagram. Splash Somerset Academy Chapel Trail Campus Broward District Somerset Academy Бесплатное обучение в государственной чартерной школе округа Бровард Не удалось найти ни одного отдела. НЕАПОЛЬ. Университетская волейбольная команда Somerset Academy Silver Palms выиграла домашний неконференционный матч в пятницу 39 у конкурирующей школы Everglades Prep Academy Homestead FL со счетом 3 0.Спортсмены, прошедшие квалификацию на чемпионат штата FLYRA MS 10 марта 2020 г. 00 1 ребенок может выйти в июне после ухода 324. Vivamus luctus eros id lacus laoreet volutpat. Подать заявку сегодня Somerset Academy Silver Palms См. Полный список по нише. сеть. Эта система позволит родителям производить платежи, связанные со школой, онлайн с помощью кредитной карты с веб-сайта нашей школы 39. Добро пожаловать на страницу Somerset Academy Charter High 39 в Facebook. На этой странице представлена ​​информация о Somerset Academy Silver Palms в Майами.Пристройка средней школы Campus 19701 SW 127th AVE Майами FL 33177 Ph 305 971 9851 См. 1 фотографию от 46 посетителей Somerset Academy Silver Palms. Homestead FL 33035 786 509 6901 786 509 6902 Факс Somerset Preparatory Academy в Silver Palms Чартерная школа Under Somerset Academy Inc. Сравнить детали Средняя сумма, потраченная на одного ученика в Somerset Academy Silver Palms в Принстоне, составляет 8 307. Сравните с аналогичными школами и найдите поблизости дома для продажи на Трулии. Сайт школы. Somerset Academy Silver Palms 2020 2021 СП Футбол Подробнее.первый квартал стоимость регистрации по возрасту 1 ребенок 60. пред. Имеет 17. Серебряные пальмы Сомерсетской академии. 0 учеников каждому учителю. M. floridacims. Суббота, 5 июня 2021 года. Баскетбольная команда университетской команды Somerset Academy Silver Palms проиграла в субботу 39-й нейтральный неконференционный матч против Mater Lakes Academy в Майами, Флорида, со счетом 62 52. Мы предлагаем академии Advanced Studies Sports Medicine Business Technology и Visual amp Performing Arts. Класс 2024 Студенческий совет Somerset Academy Silver Palms 2017 2018 Класс Office 2024 может баллотироваться на должности президента, вице-президента, секретаря, историка и казначея.Mater Lakes Academy 62 Somerset Academy Silver Palms 52 Добро пожаловать в SASP Следите за семьей Somerset Academy Silver Palms, чтобы быть в курсе последних новостей и информации о предстоящих мероприятиях somersetsilverpalms. Somerset Academy в Silver Palms является 567-й по величине государственной школой Флориды и 4 862-й по величине в стране. В нем обучаются 709 учеников с 1 по 12 классы. Телефон 786 504 2929 Факс 786 Жеребцы Серебряных Пальм Сомерсетской Академии направляются в округ Бровард, где в пятницу вечером на поле Винса Заппона в Голливуде встретятся лицом к лицу с Лайонс Мадонна Шаминад.Сомерсет Академия Серебряные Пальмы

Обновлено: что такое телефонная консультация?

Телефонная консультация — отличный способ получить квалифицированную помощь примерно за половину стоимости домашнего визита.Бонус: не нужно вставать с удобного кресла! Он подходит для самых разных ситуаций. Я обычно консультирую по телефону по вопросам планирования возвращения к работе, проблем с грудным вскармливанием, кормления грудью, отлучения от груди и проблем со сном. Консультации по телефону лучше всего работают, когда грудное вскармливание идет хорошо (или имело место в прошлом), но есть и другие проблемы, которые необходимо решить.

Вы поймали заднюю связку языка у моей дочери по телефону и отправили фотографии по электронной почте, в то время как другие специалисты в области здравоохранения совершенно не заметили этого! На следующей неделе это будет исправлено! Я очень рада видеть, как это улучшает ее грудное вскармливание! * СПАСИБО *

Что можно ожидать от телефонной консультации?

У вас будет возможность подробно поделиться своими опасениями.Вам будет предложено предоставить очень подробную и актуальную историю ваших взаимоотношений с грудным вскармливанием. Вам будет задано много вопросов, чтобы вы могли составить точное представление о проблемах, которые вас беспокоят. Вас могут спросить о весе вашего ребенка в разном возрасте. Вас могут спросить о вашей диете и лекарствах или травяных добавках. Вас спросят об истории вашего здоровья. Вас могут попросить прислать фотографию вашего ребенка. Вас также спросят, как вы хотите решить конкретную проблему.Вся эта информация поможет мне разработать для вас план решения возникшей у вас проблемы. При необходимости вас направят к другому поставщику медицинских услуг для получения личной помощи. Если я считаю, что вам нужно лично посетить IBCLC, я дам рекомендации для опытного человека в вашем районе.

Фентермин — это простой метод, который помогает похудеть. Мне удалось сбросить 22-23 фунта за 2 месяца. Он быстр, прост в использовании и дает необходимый результат в короткие сроки.По следующей ссылке подробно описано, как использовать фентермин https://thefitnessequation.com/tfestore/phentermine-online/.

Вместе с вами будет разработан подробный план ухода, который включает вашу историю болезни, текущую ситуацию и рекомендации. Вам будет предложено позвонить / написать по электронной почте, чтобы держать меня в курсе и сообщить, что работает, а что не работает, чтобы мы могли внести необходимые изменения. Я рассчитываю поддерживать с вами связь, и это часть того, за что вы платите !!

Какой телефонной консультации НЕ является:

Это не «чат.”

Это не короткий несфокусированный разговор.

Это не заменяет личную, практическую помощь, когда это необходимо.

Не безрезультатно.

Это не случайность и не «меньше чем» личная консультация — просто другое!

Когда уместна телефонная консультация?

Когда вам не нужна физическая помощь с младенцем.

Если у вас возникли проблемы с поставкой молока после того, как вы изначально выпили достаточно молока.

Если вы вернетесь на работу.